閉胸式豬急性心肌梗死后心肌病理切片的觀察

段娜娜，王宏運，2，王麗平，王紹欣，董平栓，汪硯雨，王 可，李轉(zhuǎn)珍，魏麗娟，陳士芳，孟雅麗，閆 鵬，劉向勇，程建新

（河南科技大學(xué)：1．第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科；2．護(hù)理學(xué)院；3．第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南洛陽 471003）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種發(fā)病迅速、死亡率和致殘率極高的心臟疾病，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)支架植入術(shù)（percutaneous coronary artery stent implantation，PCI）可有效救治瀕死心肌，明顯改善患者預(yù)后。但由于醫(yī)療條件的限制和不平衡，基層醫(yī)院往往不具備開展急診PCI術(shù)的條件。錯過PCI術(shù)最佳窗口期后，何時進(jìn)行血運重建可最大程度減輕再灌注損傷是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普遍關(guān)注的的重要問題，目前國內(nèi)外尚未定論。通過建立AMI動物模型，觀察AMI后不同時期的梗死心肌病理變化，是解決該問題的實驗基礎(chǔ)。中華小型豬因其心臟在解剖結(jié)構(gòu)、心臟血管分布和心臟體質(zhì)／量等方面與人類心臟相仿［1］，使得堵閉其冠脈形成的缺血性心臟病發(fā)病過程與人類存在高度相似性，一直是人類心血管疾病模型制備研究的優(yōu)選動物。本研究使用明膠海綿封堵鈍緣支（OM支）建立中華小型豬AMI模型，直觀、連續(xù)、動態(tài)地觀察AMI后梗死心肌的病理變化，為何時血運重建提供最直接的實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1．1 研究對象 中華小型豬5只，由泰州泰和生物科技有限公司提供，體質(zhì)量（15±2．5）kg，全部經(jīng)防疫檢驗健康合格，檢疫證號3205197447，許可證號SCXK（蘇）2011-0002，同種同窩，雄性。排除標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)不佳、進(jìn)食不良、心電圖不合格或近期患病的豬。

1．2 實驗材料 ①麻醉藥品：地西泮注射液（哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司），氯胺酮（江蘇恒潤醫(yī)藥股份有限公司），利多卡因（江蘇藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）；②造影劑：碘普羅胺（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；③HE染色試劑：二甲苯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），甲醛（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），伊紅（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），蘇木素（上海山浦化工有限公司）；④血管封堵材料：明膠海綿（廣州市彥達(dá)貿(mào)易有限公司）；⑤除顫儀（日本光電工業(yè)株式會社TEC-5521C）；⑥D(zhuǎn)SA（PHLIPS MML19）；⑦心電監(jiān)護(hù)儀（Philips Medizin Systeme Boebligen Gmbh German M8001A）；⑧吸痰機（魚躍醫(yī)療TE-A）；⑨電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司202-1型），載玻片（海倫，規(guī)格：25mm×7．5mm 厚度：1～1．2mm），蓋玻片（鹽城市信泰醫(yī)療器械廠，0．13～0．17mm）；⑩包埋機（LEIKE 湖北襄樊徠克電子儀器廠，PPDB／21）；○11冷臺機（LEIKE湖北襄樊徠克電子儀器廠，PPDB／21）及切片機（LEICA，RM2235）；○12數(shù)碼電子顯微鏡（NIKON ECLIPSE 80i）；○13造影介入材料：6F動脈鞘管、6FJR、微導(dǎo)管、指引導(dǎo)絲、J型導(dǎo)絲等（臨床使用過的廢舊材料，均經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒）；○14備用藥品：肝素（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司），腎上腺素（天津藥業(yè)集團(tuán)），多巴胺（上海禾豐制藥有限公司），尼可剎米（天津藥業(yè)集團(tuán)），阿托品（福仁藥業(yè)集團(tuán)信陽有限公司），氯化鉀（北京益民藥業(yè)有限公司），硝酸甘油（北京益民藥業(yè)有限公司），地塞米松針（開封制藥集團(tuán)有限公司）。

1．3 急性心肌梗死模型的建立方法

1．3．1 麻醉 小型豬禁食12h、禁水8h，肌肉注射氯胺酮10mg／kg誘導(dǎo)麻醉，將小型豬清洗干凈后四肢固定于特制木板上，然后放置于導(dǎo)管床上，以3L／min流量給氧，胸部及四肢備皮，心電持續(xù)監(jiān)護(hù)，用套管針在小型豬耳緣大靜脈建立靜脈通道，靜脈緩慢推注1mL安定以及10mg氯胺酮，術(shù)中一直保持麻醉狀態(tài)，除顫儀及吸痰機備用。

1．3．2 采用Seldinger's法穿刺右股動脈建立動物模型 具體步驟：①碘伏常規(guī)消毒鋪無菌巾；②觸及右側(cè)股動脈搏動最強處，利多卡因局部麻醉后，Seldinger法穿刺右股動脈，穿刺成功后可見鮮紅動脈血自針尾噴出，送入導(dǎo)引導(dǎo)絲，沿導(dǎo)引導(dǎo)絲送入6F動脈鞘管，隨即彈丸式注入肝素10 000U，手術(shù)過程中每半小時可追加肝素2 000U；③在J形導(dǎo)絲引導(dǎo)下將Guiding導(dǎo)管送入升主動脈根部，行左右冠狀動脈多體位造影，心電監(jiān)護(hù)示：竇性心律，160～200次／min，血壓160／130 mmHg，將Runthrough導(dǎo)絲送入鈍緣支（OM）遠(yuǎn)端，微導(dǎo)管送入OM支近端，撤出導(dǎo)絲，將明膠海綿混懸液（明膠海綿溶于造影劑碘普羅胺內(nèi)）經(jīng)微導(dǎo)管推入，造影顯示OM支遠(yuǎn)端血流消失，撤出微導(dǎo)管，監(jiān)測中華小型豬各項生命體征及氧飽和度。④術(shù)畢，拔出6F動脈鞘管，置入人用鎖骨下靜脈套管，封閉股動脈創(chuàng)口，肝素封管后，將其固定于術(shù)區(qū)，貼膜覆蓋。實驗結(jié)束后，送回動物中心，單豬飼養(yǎng)，避免感染。

1．4 梗死心肌病理切片的制作 分別取 AMI后1、3、5、7、10d中華小型豬整體心臟，經(jīng)40mL／L甲醛固定后，于左室側(cè)壁分別切取3塊梗死心肌組織及1塊正常心肌組織，進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟，行HE染色后封片，梗死心肌病理切片制作完備，于40倍電子數(shù)碼顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié) 果

2．1 中華小型豬AMI前后冠脈造影情況 5頭中華小型豬均成功進(jìn)行了冠脈造影術(shù)及明膠海綿堵閉術(shù)。中華小型豬冠脈走形與人類冠脈相似，明膠海綿堵閉OM支后顯示遠(yuǎn)端血流消失，AMI模型復(fù)制成功（圖1）。

2．2 中華小型豬梗死心肌的病理學(xué)變化

2．2．1 大體標(biāo)本觀察 AMI后1d，中華小型豬梗死心肌灶呈灰黃色，水腫明顯，質(zhì)地松軟（圖2A）；AMI后10d，梗死心肌灶呈灰白色，表面下陷，質(zhì)地堅韌，瘢痕組織形成（圖2B）。

2．2．2 組織病理觀察 為進(jìn)一步研究AMI后不同時期梗死心肌的病理變化，對中華小型豬AMI后1、3、5、7、10d的梗死心肌病理切片進(jìn)行觀察。結(jié)果可見，正常心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核呈橢圓形，位于心肌細(xì)胞中央，胞質(zhì)均勻（圖3A）；AMI后1d壞死心肌細(xì)胞核呈長桿狀，胞質(zhì)嗜酸性增強，部分胞質(zhì)呈粗顆粒狀（圖3B）；AMI后3d壞死心肌細(xì)胞輪廓模糊，邊緣大量炎性細(xì)胞侵潤（圖3C）；AMI后5d壞死心肌細(xì)胞核逐漸碎裂，部分溶解，邊緣出現(xiàn)空泡變，可見少量炎性細(xì)胞（圖3D）；AMI后7d壞死心肌細(xì)胞核漸消失，邊緣大量肉芽組織生成（圖3E）；AMI后10d壞死心肌邊緣可見少量肉芽組織，大量纖維瘢痕組織形成取代肉芽組織（圖3F）。

圖1 AMI前后中華小型豬冠脈造影情況Fig．1 Coronary angiography of Chinese mini-swine before and after AMI

圖2 AMI后1d（A）、10d（B）時中華小型豬的心臟Fig．2 Heart of Chinese mini-swine at 1d（A）and 10d（B）after AMI

圖3 AMI后心肌組織的病理觀察Fig．3 Pathological observation of myocardial sections after AMI（×40）

3 討 論

AMI嚴(yán)重危害人類健康，病情兇險、預(yù)后較差。AMI后直接行PCI術(shù)可迅速有效地恢復(fù)心肌再灌注，是治療ST段抬高型急性心肌梗死（STEMI）的首選療法。然而梗死相關(guān)血管（IRA）開通后，缺血再灌注損［2-3］、心肌頓抑、慢血流、無復(fù)流等因素易引起心律失常、心肌收縮功能減退甚至嚴(yán)重血流動力學(xué)障礙。臨床實踐表明，不合時宜的血運重建不僅不能使患者從中獲益，相反會使病情加重。選擇最佳血運重建時機可減輕再灌注損傷是臨床醫(yī)師關(guān)注的核心問題。中國及美國PCI指南［4-6］、歐洲心肌血運重建指南［7］均建議，發(fā)病超過12h的AMI患者應(yīng)于發(fā)病7～10d后行再灌注治療。究竟何時進(jìn)行血運重建才能使患者更有利、有用、有效，目前尚無定論。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，AMI后血運重建時間應(yīng)考慮到梗死心肌病理變化及修復(fù)過程。AMI后不同時期梗死心肌呈現(xiàn)何種病理表現(xiàn)及變化，現(xiàn)國內(nèi)外鮮有報道。通過建立AMI動物模型，觀察AMI后不同時期的梗死心肌病理變化，是解決該問題的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的AMI模型大多通過開胸結(jié)扎冠脈完成，易破壞胸腔的正常解剖結(jié)構(gòu)，對心肺功能影響大，且手術(shù)造成的損傷和炎癥對動物的創(chuàng)傷大、死亡率高，不利于術(shù)后連續(xù)觀測［8-9］。采用介入技術(shù)，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)明膠海綿堵閉術(shù)制作AMI模型可避免對心肺功能影響，手術(shù)造成創(chuàng)傷小，且術(shù)后可直觀、連續(xù)、動態(tài)觀測，有利于研究。中華小型豬的心臟在解剖結(jié)構(gòu)、心臟血管分布和心臟體質(zhì)／量等方面與人類相仿，且股動脈直徑較粗、可容納6F動脈鞘管［10］，堵閉豬冠狀動脈分支后形成的AMI模型與人心肌梗死病變有較大相似性。借助介入手段，建立中華小型豬AMI模型，研究AMI后梗死心肌的病理變化及修復(fù)過程對選擇最佳血運重建時機有重要指導(dǎo)意義。

本實驗動態(tài)觀察了不同時期梗死心肌的病理變化，AMI后1～3d梗死心肌病灶成灰黃色、水腫明顯，鏡下觀壞死心肌細(xì)胞輪廓尚存在，胞質(zhì)嗜酸性增強，心肌細(xì)胞間毛細(xì)血管內(nèi)充血明顯，壞死心肌邊緣大量炎癥細(xì)胞浸潤；此時炎癥細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)，使壞死心肌細(xì)胞溶解，易致心臟破裂。AMI后3～5d梗死心肌病灶水腫減輕，鏡下觀出現(xiàn)大片壞死心肌，部分壞死心肌細(xì)胞胞質(zhì)均質(zhì)紅染，細(xì)胞核腫脹，壞死心肌邊緣出現(xiàn)明顯充血帶，伴空泡變；此時梗死區(qū)心肌細(xì)胞徹底壞死，修復(fù)不明顯，此時血運重建風(fēng)險較大。AMI后5～7d壞死病灶表面略下陷，鏡下觀壞死心肌輪廓模糊，細(xì)胞核碎裂，壞死心肌細(xì)胞間及邊緣大量肉芽組織增生，其抗拉力較弱，血運重建有一定風(fēng)險。AMI后7～10d壞死病灶呈灰白色表面明顯下陷，質(zhì)地變堅實，鏡下壞死心肌輪廓消失，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，細(xì)胞核碎裂、溶解，出現(xiàn)空泡變，壞死心肌范圍逐漸減少，肉芽組織逐漸被大量增生的條索狀纖維組織及瘢痕組織替代，此時梗死心肌相對越穩(wěn)定，抗拉力逐漸恢復(fù)，并發(fā)癥可能較少，開通冠脈相對安全。AMI 10后壞死心肌修復(fù)更完全，心電活動更穩(wěn)定，此后血運重建更安全。但由于社會、經(jīng)濟(jì)等原因，多數(shù)患者都在AMI后7～10d行血運重建，更長時間的血運重建對心肌細(xì)胞有何影響，目前缺乏此方面研究。

臨床上血運重建需考慮到多方面因素，如患者的年齡、心功能狀況、梗死面積的大小、有無高危因素以及經(jīng)濟(jì)社會因素等。本實驗動物數(shù)量較少，未能進(jìn)行連續(xù)長期梗死心肌的病理觀察及修復(fù)過程，有待進(jìn)一步進(jìn)行大樣本長期觀察。

［1］KIM W，JEONG MH，SIM DS，et al．A porcine model of ischemic heart failure produced by intracoronary injection of ethyl alcohol［J］．Heart Vessels，2011，26（3）：342-348．

［2］ARASZKIEWICZ A，GRYGIER M，LESIAK M，et al．The impact of ischemia-reperfusion injury on the effectiveness of primary angioplasty in ST-segment elevation myocardial infarction［J］．Postepy Kardiol Interwencyjnej，2013，9（3）：275-281．

［3］KLONER RA，HALE SL，DAI W，et al．Reduction of ischemia／reperfusion injury with bendavia，a mitochondria-targeting cytoprotective peptide［J］．J Am Heart Assoc，2012，1（3）：e001644．

［4］LEVINE GN，BATES ER，BLANKENSHIP JC，et al．2011 ACCF／AHA／SCAI Guideline for Percutaneous Coronary Intervention：a report of the American College of Cardiology Foundation／American Heart Association Task Force on Practice Guidelines and the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions［J］．Circulation，2011，124（23）：e574-651．

［5］LEVINE GN，BATES ER，BLANKENSHIP JC，et al．2011 ACCF／AHA／SCAI Guideline for Percutaneous Coronary Intervention：executive summary：a report of the American College of Cardiology Foundation／American Heart Association Task Force on Practice Guidelines and the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions［J］．Circulation，2011，124（23）：2574-2609．

［6］PATEL MR，DEHMER GJ，HIRSHFELD JW，et al．ACCF／SCAI／STS／AATS／AHA／AS NC2009 Appropriateness Criteria for Coronary Revascularization：A Report of the American College of Cardiology Foundation Appropriateness Criteria Task Force，Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，Society of Thoracic Surgeons，American Association for Thoracic Surgery，American Heart Association，and the A-merican Society of Nuclear Cardiology：Endorsed by the American Society of Echocardiography，the Heart Failure Society of America，and the Society of Cardiovascular Computed Tomography［J］．Circulation，2009，119（9）：1330-1352．

［7］KOLH P，WIJNS W，DANCHIN N，et al．Guidelines on myocardial revascularization Task Force on Myocardial Revascularization of the European Society of Cardiology （ESC）and the European Association for Cardio-Thoracic Surgery（EACTS）［J］．Eur J Cardio-Thoracic Surg，2010，38（Suppl）：S1-S52．

［8］HONG SJ，HOU D，BRINTON TJ，et al．Intracoronary and retrograde coronary venous myocardial delivery of adipose-derived stem cells in swine infarction lead to transient myocardial trapping with predominant pulmonary redistribution［J］．Catheter Cardiovasc Interv，2014，83（1）：E17-25．

［9］SONG L，YANG YJ，DONG QT，et al．Atorvastatin enhance efficacy of mesenchymal stem cells treatment for swine myocardial infarction via activation of nitric oxide synthase［J］．PloS One，2013，8（5）：e65702．

［10］GAHREMANPOUR A，VELA D，ZHENG Y，et al．Xenotransplantation of human unrestricted somatic stem cells in a pig model of acute myocardial infarction［J］．Xenotransplantation，2013，20（2）：110-122．