大蒜素上調(diào)蛋白亞硝基化抗動(dòng)脈粥樣硬化研究

林 燕，陳玉龍，黃炳俏，朱寧紅，楊佩剛，4，白 亮，翟夢(mèng)君，劉恩岐，

（1．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，陜西西安 710061；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管中心脂代謝與動(dòng)脈粥樣硬化研究室，陜西西安 710061；3．西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710021；4．西安交通大學(xué)經(jīng)濟(jì)與金融學(xué)院，陜西西安 710061；5．湖北省襄陽市口腔醫(yī)院頜面外科，湖北襄陽 441003）

亞硝基化是一氧化氮（nitric oxide，NO）與蛋白質(zhì)的半胱氨酸巰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，以共價(jià)鍵可逆性結(jié)合形成S-NO鍵導(dǎo)致蛋白亞硝基化，最終生成亞硝基硫醇的過程［1-2］。與蛋白質(zhì)磷酸化一樣，蛋白亞硝基化普遍存在于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中，是一種非常重要的蛋白翻譯后修飾過程［1］。NO主要通過兩條途徑發(fā)揮生物學(xué)作用：環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）依賴途徑和cGMP非依賴途徑。近年來，cGMP非依賴途徑是心血管研究的熱點(diǎn)。在該途徑中，NO能夠通過對(duì)蛋白的亞硝基化修飾調(diào)節(jié)血管多種生物學(xué)功能［3］。大蒜素是從大蒜的鱗莖中提取的一種具有揮發(fā)性的硫化物。最近的研究表明，大蒜素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞NO水平有關(guān)［4］。然而，NO在大蒜素抗動(dòng)脈粥樣硬化作用中的具體機(jī)制不詳。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的亞硝基化是NO在心血管疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的重要機(jī)制之一［3］。大蒜素能否通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白亞硝基化水平發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠，觀察大蒜素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的影響，并從內(nèi)皮細(xì)胞蛋白亞硝基化的角度初步探討大蒜素的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制，為大蒜素抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究提供一種新視角。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 大蒜素購自上海禾豐制藥有限公司；血脂檢測(cè)試劑盒為北京中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品；小鼠血漿氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow density lipoprotein，ox-LDL）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）檢測(cè) ELISA試劑盒購自美國RD公司；兔抗小鼠galectin 3多克隆抗體、兔抗小鼠α-actin單克隆抗體和兔抗亞硝基化的半胱氨酸多克隆抗體均購自英國Abcam公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）及DAB顯色液購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；Ⅰ型膠原酶購自美國Gbico公司；NO及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；M199培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國Hyclone公司生產(chǎn)；內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物購自美國Scien Cell Research公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）購自美國Santa Cruz公司；ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 8周齡雄性apoE-／-小鼠30只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、大蒜素低劑量組（LA組）、大蒜素高劑量組（HA組）。3組動(dòng)物均給予高膽固醇飲食（含21%脂肪，0．15%膽固醇）喂養(yǎng)12周。LA組每日給予大蒜素9mg／kg，HA組每日給予大蒜素18 mg／kg，均用生理鹽水稀釋后灌胃給藥，對(duì)照組每日給予灌胃等體積的生理鹽水［5］。動(dòng)物自由攝食及飲水，分籠（3或4只／籠）飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境。SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（20±2）℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日明暗室各12h。每周稱量動(dòng)物的體重及剩余飼料。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理委員會(huì)依據(jù)西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物準(zhǔn)則和美國國家健康委員會(huì)出版的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物福利和使用準(zhǔn)則（NIH Publication No．85-23，revised 2011）批準(zhǔn)實(shí)施。

1．3 apoE-／-小鼠血脂、血漿 NO、MDA、ox-LDL以及TNF-α水平的檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)開始后0、4、8、12周，采用肝素處理的毛細(xì)玻璃管于小鼠尾部采血，每只小鼠采血量為3支毛細(xì)玻璃管。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉小鼠，摘眼球最大量采血。每次采血前小鼠禁食最少8h。3 000r／min離心10min，取上清，待測(cè)血漿指標(biāo)。血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白 膽 固 醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、NO及MDA均按照試劑盒提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。血漿ox-LDL和TNF-α水平均采用小鼠ELISA試劑盒檢測(cè)。具體步驟均參照說明書操作。

1．4 apoE-／-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊的病理學(xué)觀察以及血管蛋白亞硝基化水平的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束采集血液標(biāo)本之后，用磷酸鹽緩沖溶液從左心室逆行灌注主動(dòng)脈后，自心臟至腹主動(dòng)脈末端左右髂總動(dòng)脈分叉離斷整個(gè)動(dòng)脈樹。將所有小鼠心臟連帶近心端2～3 mm主動(dòng)脈切下，制備主動(dòng)脈根部8μm厚連續(xù)冰凍切片。冰凍切片每間隔8張取1張，進(jìn)行蘇木精伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）和范吉爾森彈性纖維（elastica van Gieson，EVG）染色，分析大蒜素對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形態(tài)及大小的影響；免疫組化染色分析大蒜素對(duì)其主動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞（macrophage，MΦ）和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）含 量 的 影響［6］。各標(biāo)本經(jīng)組織化學(xué)染色后均采集圖像，應(yīng)用Win ROOF V6．5（Mitani Co．，Ltd．，F(xiàn)ukui，Japan）圖像分析軟件計(jì)算斑塊及其組分面積［6］。

免疫熒光分析大蒜素對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部蛋白亞硝基化水平的影響。主動(dòng)脈根部冰凍切片室溫放置30min后，丙酮室溫固定10min，透化液（含1mL／L Trion X-100，30g／L牛血清白蛋白）室溫透化15min，50 mL／L山羊血清室溫封閉30min，兔抗亞硝基化的半胱氨酸多克隆抗體（1∶100）4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）室溫孵育60min，DAPI染核15min后，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖片［7］。

1．5 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由新鮮的人臍帶用1g／LⅠ型膠原酶消化法分離獲得后，用含有200mL／L胎牛血清、100U／mL青霉素、100mg／mL鏈霉素、40μg／mL肝素鈉以及10g／L內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。HUVECs完全融合成典型的“鋪路石”狀時(shí)，用胰酶消化液（0．5g／L的胰蛋白酶＋0．2g／L的ED-TANa2）消化并傳代，第3代用于實(shí)驗(yàn)。

待細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，用含20mL／L胎牛血清的M199培養(yǎng)基饑餓18h后，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、安慰劑組［溶解藥物等體積的DMSO＋ox-LDL（50μg／mL）］，低劑量大蒜素組［大蒜素（10μmol／L）＋ox-LDL（50μg／mL）］、高劑量大蒜素組［大蒜素（20μmol／L）＋ox-LDL（50μg／mL）］［8］。分別處理24h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)所用臍帶均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院提供，本研究獲得西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)許可。

1．6 檢測(cè)HUVECs培養(yǎng)上清液NO及HUVECs蛋白亞硝基化水平 采用硝酸還原酶法檢測(cè)上清中NO水平，具體步驟參照說明書操作。細(xì)胞爬片經(jīng)40 g／L多聚甲醛室溫固定后，免疫熒光法標(biāo)記 HUVECs亞硝基化蛋白（具體步驟同主動(dòng)脈根部免疫熒光法），甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖片，利用Image-Pro Plus軟件分析熒光強(qiáng)度［7］。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行描述，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布及方差齊性后采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析、單因素方差分析結(jié)合Tukey's test檢驗(yàn)分別對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若不滿足正態(tài)性和方差齊性的條件則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 大蒜素對(duì)血脂水平影響 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布、方差齊，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間飼料消耗和體重變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各組小鼠血漿 TC（P＝0．001）、TG（P＝0．001）、LDL-C（P＝0．001）和 HDL-C（P＝0．023）水平的升高具有時(shí)間依賴性；與對(duì)照組相比，高、低劑量組小鼠血漿TC（P＝0．708）、TG（P＝0．324）和LDL-C（P＝0．763）水平均有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2．2 大蒜素對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布、方差齊，與對(duì)照組相比，大蒜素處理組血漿ox-LDL、MDA和TNF-α均明顯下降（圖2）。LA組和HA組血漿ox-LDL分別下降了27．82% （P＝0．014）、26．39%（P＝0．029）；MDA分別下降了38．86%（P＝0．028）和40．87%（P＝0．029）；TNF-α分別下降了58．92%（P＝0．001）和54．71%（P＝0．002）。LA組和HA組間的血漿ox-LDL、MDA和TNF-α差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 大蒜素對(duì)高膽固醇飲食apoE-／-小鼠血脂 TC（A）、TG（B）、LDL-C（C）及HDL-C（D）水平的影響Fig．1 The effects of allicin on the levels of plasma lipids TC（A），TG（B），LDL-C（C）and HDL-C（D）in apoE-／-mice fed with high cholesterol diet

圖2 大蒜素對(duì)小鼠血漿ox-LDL（A）、MDA（B）、TNF-α（C）的影響Fig．2 The effects of allicin on ox-LDL （A），MDA （B），TNF-α（C）in mice fed with high cholesterol diet

2．3 大蒜素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，3組小鼠主動(dòng)脈根部均見斑塊形成，斑塊內(nèi)見大量泡沫細(xì)胞散在分布，并見脂核（圖3A）。EVG染色及免疫組化染色定量結(jié)果經(jīng)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布、方差齊。與對(duì)照組相比，LA組和HA組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積顯著減少，分別減少了46．29%（P＝0．003）和39．67%（P＝0．012）（圖3B）；LA組和HA組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊中MΦ及VSMC的含量均明顯減少，MΦ分別減少了31．58%（P＝0．02）和30．12%（P＝0．027），VSMC分別減少了40．18%（P＝0．018）和37．95%（P＝0．026）（圖3B）；但LA組和 HA組間上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．4 大蒜素對(duì)小鼠血漿NO水平及主動(dòng)脈根部蛋白亞硝基化水平的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布、方差齊，與對(duì)照組相比，LA組和HA組小鼠血漿NO水平均顯著升高，分別升高了57．24%（P＝0．044）和69．41%（P＝0．019）（圖4）。與血漿NO水平變化趨勢(shì)一致，大蒜素處理后小鼠主動(dòng)脈根部蛋白亞硝基化水平較對(duì)照組明顯升高（圖5）。

2．5 大蒜素對(duì)HUVECs產(chǎn)生NO及其蛋白亞硝基化水平的影響 各組HUVECs經(jīng)不同因素處理24h后，細(xì)胞形態(tài)正常。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清NO水平及細(xì)胞蛋白亞硝基化水平均為正態(tài)分布、方差齊。上清中NO檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，安慰劑組NO水平顯著減少（P＝0．001），而高低劑量大蒜素處理組NO水平較安慰劑組顯著升高（P均＝0．002）；與上清液中NO水平變化趨勢(shì)一致，與對(duì)照組相比，安慰劑組HUVECs蛋白亞硝基化水平顯著下降（P＝0．001），而高低劑量大蒜素處理組 HUVECs蛋白亞硝基化水平較安慰劑組顯著升高（均P＝0．002）（圖6）；但兩大蒜素處理組間上清液中NO水平及HUVECs蛋白亞硝基化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 大蒜素對(duì)高膽固醇飲食喂養(yǎng)的apoE-／-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊形成的影響Fig．3 Histological analysis of aortic atherosclerosis in apoE-／-mice fed with high cholesterol diet

圖4 大蒜素對(duì)小鼠血漿NO水平的影響Fig．4 The effects of allicin on NO in mice fed with high cholesterol diet

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠明顯抑制高膽固醇飲食誘導(dǎo)的apoE-／-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。結(jié)果顯示，大蒜素不僅能夠減少主動(dòng)脈根部斑塊的面積，也能夠抑制斑塊內(nèi)MΦ和VSMC的含量；大蒜素還能夠顯著減少血漿ox-LDL、MDA和TNF-α水平，同時(shí)增加血漿NO及主動(dòng)脈根部蛋白亞硝基化水平。另外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素能夠恢復(fù)由ox-LDL所導(dǎo)致HUVECs產(chǎn)生NO及其蛋白亞硝基化水平的抑制。

圖5 大蒜素對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部蛋白亞硝基化水平的影響Fig．5 The effects of allicin on protein S-nitrosylation of the aortic root in the mouse model（×100）

圖6 大蒜素處理對(duì)培養(yǎng)HUVECs NO的產(chǎn)生及蛋白亞硝基化水平的影響Fig．6 The effects of allicin on protein S-nitrosylation and NO release in HUVECs（×200）

NO生物利用度的減少是內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的主要特征性表現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂又是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展整個(gè)階段中的起始環(huán)節(jié)［9］。近年的研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白亞硝基化修飾是NO發(fā)揮血管調(diào)節(jié)的重要途徑。蛋白亞硝基化是一種體內(nèi)廣泛存在的翻譯后修飾，能夠影響細(xì)胞的代謝過程，從而調(diào)控血管功能。迄今為止，被鑒定出的內(nèi)皮細(xì)胞亞硝基化蛋白已達(dá)100多種。這些經(jīng)亞硝基化修飾的蛋白在調(diào)控炎癥、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生長以及血管僵硬度方面發(fā)揮重要作用［10-15］。體內(nèi)的NO主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）分解L-精氨酸產(chǎn)生。在完整的血管中，大部分NO由內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮NOS（endothelial NOS，eNOS）產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)大蒜素處理組小鼠的血漿NO水平及主動(dòng)脈根部總蛋白亞硝基化水平均明顯升高。這可能與大蒜素提高內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS活性有關(guān)，并且NO調(diào)節(jié)細(xì)胞功能主要通過蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基亞硝基化修飾介導(dǎo)［16］。為了研究血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白亞硝基化水平變化，本實(shí)驗(yàn)還觀察了大蒜素對(duì)ox-LDL刺激的HUVECs產(chǎn)生NO及蛋白亞硝基化水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合用大蒜素處理HUVECs后，其NO水平及蛋白亞硝基化水平明顯高于ox-LDL單獨(dú)刺激組，而ox-LDL能夠明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO及其蛋白亞硝基化水平。即大蒜素能夠有效改善ox-LDL所引起的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO及發(fā)生蛋白亞硝基化水平的下降。

另外，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮很重要的作用［17-18］。大蒜素能夠有效清除超氧陰離子和羥自由基，使脂質(zhì)過氧化水平降低，從而有效地減輕其對(duì)血管內(nèi)皮和VSMC的損傷，減少血小板在損傷部位的粘附和聚集，同時(shí)減少炎癥因子的釋放，最終發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［19］。已有研究表明，亞硝基化能夠通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的活性發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。如，NADPH還原性輔酶Ⅱ氧化酶組成因子p47phox的亞硝基化能夠抑制該酶的活化，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激［20-21］；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）亞基p65的亞硝基化能夠抑制其核轉(zhuǎn)位［22］，NF-κB亞基p50的亞硝基化能夠抑制其與DNA結(jié)合［23］，從而抑制NF-κB的活化，發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，大蒜素在促進(jìn)NO產(chǎn)生的同時(shí)，能夠減少血漿ox-LDL、MDA和TNF-α水平。這表明大蒜素具有抗氧化及抗炎作用，其作用機(jī)制可能與NO介導(dǎo)的亞硝基化作用有關(guān)。然而，大蒜素的作用效果未顯示劑量依賴效應(yīng)。

綜上所述，大蒜素具有顯著的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，與其通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白亞硝基化水平所發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎作用有關(guān)。這將為研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制及其防治提供理論基礎(chǔ)。

［1］DERAKHSHAN B，HAO G，GROSS SS．Balancing reactivity against selectivity：the evolution of protein S-nitrosylation as an effector of cell signaling by nitric oxide［J］．Cardiovasc Res，2007，75（2）：210-219．

［2］FOSTER MW，HESS DT，STAMLER JS．Protein S-nitrosylation in health and disease：a current perspective［J］．Trends Mol Med，2009，15（9）：391-404．

［3］LIMA B，F(xiàn)ORRESTER MT，HESS DT，et al．S-nitrosylation in cardiovascular signaling［J］．Circ Res，2010，106（4）：633-646．

［4］LIU D，GAO W，LIANG E，et al．Effects of allicin on hyper-homocysteinemia-induced experimental vascular endothelial dysfunction［J］．Eur J Pharmacol，2013，714（1-3）：163-169．

［5］GONEN A，HARATS D，RABINKOV A，et al．The antiatherogenic effect of allicin：possible mode of action［J］．Pathobiology，2005，72（6）：325-334．

［6］ZHANG CF，ZHENG HD，YU Q，et al．A practical method for quantifying atherosclerotic lesions in rabbits［J］．J Comp Pathol，2010，142（2-3）：122-128．

［7］CHEN YL，ZHAO SH，WANG YL，et al．Homocysteine reduces protein S-nitrosylation in endothelium［J］．Int J Mol Med，2014，34（5）：1277-1285．

［8］HOREV-AZARIA L，ELIAV S，IZIGOV N，et al．Allicin upregulates cellular glutathione level in vascular endothelial cells［J］．Eur J Nutr，2009，48（2）：67-74．

［9］BONETTI PO，LERMAN LO，LERMAN A．Endothelial dysfunction：a marker of atherosclerotic risk［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（2）：168-175．

［10］MATSUSHITA K，MORRELL CN，CAMBIEN B，et al．Nitric oxide regulates exocytosis by S-nitrosylation of N-ethylmaleimide-sensitive factor［J］．Cell，2003，115（2）：139-150．

［11］KANG-DECKER N，CAO S，CHATTERJEE S，et al．Nitric oxide promotes endothelial cell survival signaling through S-nitrosylation and activation of dynamin-2［J］．J Cell Sci，2007，120（Pt 3）：492-501．

［12］THIBEAULT S，RAUTUREAU Y，OUBAHA M，et al．S-nitrosylation of beta-catenin by eNOS-derived NO promotes VEGF-induced endothelial cell permeability［J］．Mol Cell，2010，39（3）：468-476．

［13］PI XC，WU YX，F(xiàn)ERGUSON JE3rd，et al．SDF-1alpha stimulates JNK3 activity via eNOS-dependent nitrosylation of MKP7 to enhance endothelial migration［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（14）：5675-5680．

［14］OLIVEIRA CJ，CURCIO MF，MORAES MS，et al．The low molecular weight S-nitrosothiol，S-nitroso-N-acetylpenicillamine，promotes cell cycle progression in rabbit aortic endothelial cells［J］．Nitri Oxide，2008，18（4）：241-255．

［15］SANTHANAM L，TUDAY EC，WEBB AK，et al．Decreased S-nitrosylation of tissue transglutaminase contributes to age-related increases invascular stiffness［J］．Circ Res，2010，107（1）：117-125．

［16］HESS DT，MATSUMOTO A，KIM SO，et al．Protein S-nitrosylation：purview and parameters［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6（2）：150-166．

［17］BONOMINI F，TENGATTINI S，F(xiàn)ABIANO A，et al．Atherosclerosis and oxidative stress［J］．Histol Histopathol，2008，23（3）：381-390．

［18］LIBBY P，RIDKER PM，HANSSON GK．Inflammation in atherosclerosis：from pathophysiology to practice［J］．J Am Coll Cardiol，2009，54（23）：2129-2138．

［19］CHAN JY，YUEN AC，CHAN SW，et al．A review of the cardiovascular benefits and antioxidant properties of allicin［J］．Phytother Res，2013，27（5）：637-646．

［20］SELEMIDIS S，DUSTING GJ，PESHAVARIYA H，et al．Nitric oxide suppresses NADPH oxidase-dependent superoxide production by S-nitrosylation in human endothelial cells［J］．Cardiovasc Res，2007，75（2）：349-358．

［21］樊洪波，李冬梅，石搏，等．大豆皂苷對(duì)糖尿病大鼠心肌組織中NOX4和P22phox表達(dá)的影響及其對(duì)心肌的保護(hù)作用［J］．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，39（2）：251-254．

［22］PRASAD R，GIRI S，NATH N，et al．GSNO attenuates EAE disease by S-nitrosylation-mediated modulation of endothelialmonocyte interactions［J］．Glia，2007，55（1）：65-77．

［23］MARSHALL HE，STAMLER JS．Inhibition of NF-kappa B by S-nitrosylation［J］．Biochemistry，2001，40（6）：1688-1693．