正交法優(yōu)選丹參提取工藝研究

高　楊，王　彬，秦昆明，陳丹妮，陳林偉，金俊杰，蔡寶昌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京　210014;

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京　210023;

3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室,江蘇 南京　210046;

4.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司,江蘇省企業(yè)研究生工作站,江蘇 南京　210061)

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正交法優(yōu)選丹參提取工藝研究

高楊1，王彬2,3,4，秦昆明2,3,4，陳丹妮2,3，陳林偉2,3，金俊杰4，蔡寶昌2,3,4

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京210014;

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京210023;

3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室,江蘇 南京210046;

4.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司,江蘇省企業(yè)研究生工作站,江蘇 南京210061)

摘要:目的 優(yōu)選丹參的提取工藝。方法以丹酚酸B及丹參酮ⅡA的提取率為考察指標(biāo)，對(duì)丹參的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)法，篩選出最佳提取工藝。結(jié)果優(yōu)選出的丹參最佳提取工藝為：8倍量70%乙醇在70℃下加熱回流提取90 min。結(jié)論優(yōu)選得到的丹參提取工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：回流提??；丹酚酸B；丹參酮ⅡA；正交試驗(yàn)

丹參，為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰等功效，是臨床心血管疾病最常用中藥之一，丹參多糖具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、護(hù)肝和降血糖等功效[1-3]。研究表明，以丹參為原料藥材制成的不同劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、噴霧劑、口服液以及滴丸等，對(duì)人體的毒副作用均較小[4-7]。

丹參中主含水溶性的酚酸成分和脂溶性的二萜類成分，水溶性成分如丹酚酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸等，具有調(diào)節(jié)微循環(huán)、抗血栓、幫助組織恢復(fù)的作用。脂溶性成分如丹參酮型的二萜類化合物，主要有丹參酮ⅡA、ⅡB，隱丹參酮、異丹參酮I等，其中丹酚酸B和丹參酮ⅡA是丹參中水溶性和脂溶性成分的主要成分，二者都具有很多生物活性。丹酚酸B可以改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抗腎纖維化等[8-10]，丹參酮ⅡA具有抗炎、抗氧化[3]以及抗癌[4]等作用。關(guān)于丹參的提取工藝有較多的報(bào)道，但是丹酚酸B在高溫下易分解成紫草酸和丹參素，如圖1所示。本文通過對(duì)丹參的提取溫度、時(shí)間、次數(shù)以及溶劑(乙醇)濃度進(jìn)行單因素考察，采取回流提取法，以丹酚酸B和丹參酮ⅡA的總含量作為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選丹參提取工藝，形成丹參的提取的最佳工藝參數(shù)，以此為充分利用該藥提供重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

圖1丹酚酸B高溫分解為紫草酸和丹參素

1材料

Shimadzu LC-20 AD高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，包含島津LC-Solusion工作站、在線脫氣機(jī)、SIL-20 A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20 A紫外-可見光檢測(cè)器、CTO-20 A柱溫箱FA1104電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

丹酚酸B和丹參酮ⅡA對(duì)照品均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)分別為D-012-131112，D-008-131211,二者純度均≥98%，用于含量測(cè)定。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑為分析純。

丹參(批號(hào)：140405)，購(gòu)于南京海源中藥飲片有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒別分析為唇形科植物丹參SalviaMiltiorrhiza的干燥根莖，通過檢驗(yàn)丹參飲片符合2010版頒布的《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)前期單因素試驗(yàn)考察的結(jié)果，采用L9(3)4正交試驗(yàn)法對(duì)丹參提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。以丹參中的丹酚酸 B和丹參酮 ⅡA的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取時(shí)間(A)、溫度(B)、溶劑濃度(C)、液體/材料(D)進(jìn)行考察，因素水平見表1。

表1　丹參提取工藝因素水平表

2.2指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，30%～35% A；5～10 min，35% A；10～20 min，35%～75% A；20～25 min，75%～80% A；25～30 min，80%～85% A；30～35 min，85%～5% A；35～40 min，5% A，流速1.0 mL·min-1；柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)[3]：丹酚酸B 286 nm，丹參酮ⅡA 270 nm；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品和待測(cè)樣品的色譜圖見圖2。

圖2混標(biāo)(A)和丹參樣品(B)的HPLC色譜圖

2.2.2線性關(guān)系考察精密稱取丹酚酸B和丹參酮ⅡA對(duì)照品若干，溶于甲醇，制成混合對(duì)照品母液，將母液逐級(jí)稀釋為各成分質(zhì)量濃度為7.9～395，1.62～162 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，縱坐標(biāo)為峰面積，橫坐標(biāo)為對(duì)照品的濃度(mg·L-1)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程，結(jié)果見表2。

表2　丹酚酸B和丹參酮ⅡA的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.2.3待測(cè)樣品溶液的制備 取丹參粉末約2 g，精密稱量，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，濾過，合并濾液至100 mL量瓶中，分別加相應(yīng)的提取溶劑至刻度，超聲10 min，作為待測(cè)品溶液。精確移取待測(cè)樣品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得各提取液的待測(cè)液。

2.2.4方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn):精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各主要色譜峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱定丹參粉末約2 g，同法取樣6份，照“2.2.3”項(xiàng)下方法選取試驗(yàn)設(shè)計(jì)中每個(gè)因素的1個(gè)水平制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各主要色譜峰面積RSD均小于2.5%，表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行測(cè)定。各主要色譜峰峰面積的RSD均小于2.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的混合提取溶液共6份，每份2 mL，精確稱定，分別加入適量混合對(duì)照品溶液。精確移取樣品溶液5 mL，以“2.2.3”項(xiàng)下方法制備待測(cè)樣品溶液，計(jì)算回收率，丹酚酸 B和丹參酮ⅡA的平均加樣回收率分別為100.34%和99.13%，RSD分別為1.43%和0.95%(n=6)。

2.3正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析 正交試驗(yàn)方案直觀分析及方差分析結(jié)果見表3,4。本次正交設(shè)計(jì)以丹酚酸B和丹參酮ⅡA兩者提取率之和為指標(biāo)，將總指標(biāo)結(jié)果帶入正交試驗(yàn)結(jié)果，即得。

表3　提取工藝正交試驗(yàn)直觀分析

表4　提取工藝正交試驗(yàn)方差分析

注：f= 2，F(xiàn)0.1( 2，2)= 9.00，F(xiàn)0. 05( 2，2)= 19.00。

直觀分析結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，按丹酚酸 B和丹參酮ⅡA兩種成分含量總和進(jìn)行判定，各因素對(duì)丹參提取工藝的影響依次為B>A>D>C，即提取溫度>時(shí)間>液體/材料>乙醇濃度，且提取溫度在提取過程中起重要作用(P<0.05)；由方差分析結(jié)果可見，因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不明顯，最終選擇A2B2C2D1作為本實(shí)驗(yàn)的最佳提取條件，即加入8倍量70%濃度的乙醇在70℃下加熱回流提取90 min。

2.4工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選的工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5。以優(yōu)化工藝作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行丹參提取，其提取液中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量都較高。試驗(yàn)結(jié)果表明，所優(yōu)化的提取工藝合理可行，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表5　提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3討論

3.1評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 丹酚酸 B和丹參酮 ⅡA為丹參的有效成分，較其他成分高，也是其水溶性成分和脂溶性成分的代表性成分，同時(shí)二者具有較高的生物活性，在治療心血管疾病中有很好的治療作用。選擇丹酚酸B和丹參酮ⅡA作為丹參提取的指標(biāo)性成分可以更全面地反映出丹參的提取效果。

3.2正交因素與水平的選擇 在正交試驗(yàn)前，首先進(jìn)行單因素考察，對(duì)提取工藝的因素與水平進(jìn)行初步篩選。目前，有關(guān)丹參提取工藝報(bào)道頗多[11-14]，對(duì)提取時(shí)間、溶劑濃度以及液體/材料皆有報(bào)道，但是對(duì)提取溫度對(duì)丹參提取效果的影響報(bào)道較少，由于丹酚酸B和丹參酮ⅡA在較高溫度狀態(tài)下都具有不穩(wěn)定性，故本實(shí)驗(yàn)在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上增加提取溫度作為丹參提取的考察因素。在單因素試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了提取溫度50～100℃等6個(gè)水平。結(jié)果表明，在相同的提取工藝條件下，70℃溫度條件下提取出的丹酚酸B和丹參酮ⅡA得率相對(duì)較高。

本文優(yōu)選丹參提取工藝，目的是用較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案同時(shí)提取丹參中水溶性和脂溶性成分，以操作簡(jiǎn)便，節(jié)約成本，控制適當(dāng)?shù)奶崛囟葴p少丹參中的有效成分分解。本文運(yùn)用高效液相色譜法來測(cè)定丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，能夠較準(zhǔn)確的測(cè)定丹參中有效成分的含量。

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基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No BK20141093)；江蘇省科技支撐計(jì)劃——工業(yè)項(xiàng)目(No BE2012011)

通信作者：蔡寶昌，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥炮制機(jī)制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail:bccai@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.008

(收稿日期：2015-06-26，修回日期：2015-08-05)

Optimization of extraction process ofSalviaeMiltiorrhizae
by Orthogonal experiment

GAO Yang1，WANG Bin2,3,4,QIN Kun-ming2,3,4,et al

(1.DepartmentofPharmacy,NanjingIntegratedTraditionalChineseAndWesternMedicine

Hospital,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210014，China;

2.CenterforStandardizationofTraditionalChineseMedicineProcessing,NanjingUniversityofChineseMedicine,

Nanjing210023,China;3.ResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineProcessing,StateAdministrationof

TraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China;4.GraduateWorkstationinEnterprisesofJiangsuProvince,

NanjingHaichangChineseMedicineGroupCo.,Ltd.,Nanjing210061,China)

Abstract:Objective To establish a method to optimize and determine the extraction technology of Salviae Miltiorrhizae. Methods In this article, an orthogonal test was conducted, with salvianolic acid B and tanshinone IIA as indexes, to detect four factors, including the extraction time, extraction temperature, the dosage of ethanol and solvent to solid ratio, and to optimize the extraction process of Salviae Miltiorrhizae.Results Optimized extraction method was as follows:8 times the amount of 70% ethanol, reflux extraction 90 min at 70℃.Conclusion Optimized extraction technology of Salviae Miltiorrhizae is stable and feasible.

Key words:reflux extraction;salvianolic acid B;tanshinone ⅡA;orthogonal test