天然活性多糖提取及分離純化技術(shù)研究進展

楊麗華，林楚慧，黃佳鑾，姚松君，高新開，李丹，胡燁敏，孟平，焦紅，陳驍熠

摘要：天然活性多糖是自然界重要的生物大分子之一，因其具有廣泛的生物活性而備受關(guān)注。由于多糖的生物活性與其純度及化學結(jié)構(gòu)有著重要的關(guān)系，因此多糖的提取和分離純化是多糖研究的基礎(chǔ)。就近年來天然活性多糖的提取方法、分離純化技術(shù)的最新研究進展進行了綜述，并比較了各種方法的優(yōu)缺點，旨在為天然活性多糖的開發(fā)應用提供參考。

關(guān)鍵詞：天然活性多糖;提取;分離純化;開發(fā)應用

中圖分類號：Q946.3;R284.2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5624-04

天然活性多糖是廣泛存在于植物、動物及微生物中由10個以上的單糖以α-或β-糖苷鍵構(gòu)成的天然大分子[1]，因其具有多種生物活性和無毒副作用，在保健食品及醫(yī)療行業(yè)中被廣泛利用。目前國內(nèi)外關(guān)于天然活性多糖的研究報道主要集中在藥理、臨床應用等方面[2-4]，有關(guān)提取和分離純化的報道相對較少。然而，多糖的生物活性與其化學結(jié)構(gòu)及純度有著重要的關(guān)系[5]，因此多糖的提取、純化是多糖研究的基礎(chǔ)。本文就近年來天然活性多糖的提取方法、分離純化技術(shù)的研究進展進行了綜述，并比較了各種方法的優(yōu)缺點，旨在為天然活性多糖的開發(fā)應用提供參考。

1 ?多糖的提取

多糖的提取是指利用一定的原理和方法將天然產(chǎn)物中的活性多糖溶出或釋放至細胞外。目前，國內(nèi)外提取多糖的方法主要有溶劑提取法、酸、堿提取法、酶解法、超聲波提取法、微波提取法和超臨界流體萃取法。

1.1 ?溶劑提取法

溶劑提取法主要是利用提取溶劑的擴散和滲透作用，將天然產(chǎn)物中活性成分溶出。一般來說，溶劑極性越大，對組織細胞的穿透力越強，提取效果就越理想。Chen等[6]用水提法提取大漏斗菇中的多糖，提取率達5.86%。曾紅亮等[7]以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，利用響應曲面法研究了金柑多糖的最佳工藝，以70%乙醇為提取溶劑，液料比為38 mL/g，在88 ℃下提取3次，每次2.5 h，得到的多糖提取率為1.80%，與理論預測值相當。

該法無需復雜的儀器設(shè)備，工藝成本相對較低，應用廣泛，但需要多次提取以保證提取率，耗時較多。此外，若使用水為提取溶劑，由于水的溶解范圍廣，在提取活性多糖的同時也浸提出大量的非多糖組分，這也增加了去除多糖中雜質(zhì)的難度。

1.2 ?酸、堿提取法

堿液提取法是利用植物細胞在堿液中會吸水溶脹以致破裂，使細胞中的活性物質(zhì)釋放出來的原理提高提取率。常用的堿液有NaOH、KOH、Na2CO3。但對于在堿性較強時會水解多糖，在實際操作中需要加入硼氫化鈉或硼氫化鉀來防止其降解。馬洪波等[8]使用氫氧化鈉溶液提取桑葉多糖，正交試驗結(jié)果顯示，1.5 mol/L堿液濃度，固液比為1∶50，在80 ℃提取4 h，多糖提取率可達2.55%，略高于水提取法。趙晨溟等[9]用幾種不同的方法提取龍眼中的多糖，結(jié)果表明，對于含半乳糖較多的多糖，堿提取法提取率較高。

堿提取法適合于提取酸性多糖或分子量較大的多糖，比溶劑提取法相對省時。但使用堿液提取法時，堿液的濃度必須要控制在適當范圍內(nèi)，如果濃度過高，會使糖苷鍵斷裂且多余的堿液與還原糖發(fā)生反應，將還原糖分解，使溶液顏色加深，加大后續(xù)的脫色工作量。

酸液提取法的原理與堿提取法基本相同，該法適用于半乳糖醛酸含量豐富的多糖的提取。使用酸提取法時同樣要嚴格控制其溶液酸度，否則會破壞多糖的結(jié)構(gòu)。

1.3 ?酶解法

酶解法是根據(jù)細胞壁的構(gòu)成，利用酶反應所具有的高度專一性等特點，選擇相應的酶將細胞壁的組成成分水解或降解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，將細胞內(nèi)有效成分提取出來的方法[10]。常用酶包括纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等。酶解法關(guān)鍵在于使酶活性達到并保持最佳狀態(tài)，這就需要考察酶用量、底物濃度、pH、溫度及作用時間等因素的影響。You等[10]使用2.15%復合酶，在pH 4.2，55 ℃溫度下提取97 min，山茱萸多糖提取率高達9.29%。

酶解法反應條件溫和，提取速度快，提取率高，可重復性好[11]，操作簡便。不足的是，酶解法存在酶殘留及酶降解產(chǎn)物的去除問題。

1.4 ?超聲波提取法

超聲波提取法是利用超聲波高頻振蕩的空化作用、機械作用和熱力學作用等破壞提取物的細胞結(jié)構(gòu)，使提取液滲入細胞內(nèi)部，加速多糖溶解，從而提高多糖提取率[12]。Qu等[13]采用超聲波提取紅棗多糖，利用響應面法考察各因素對多糖提取率的影響，結(jié)果表明，在功率120 W，溫度 55 ℃下超聲提取15 min，紅棗多糖提取率可達4.47%，與理論預測值相符。Chen等[14]用超聲波提取萬年青多糖，在最佳提取工藝下得到的多糖含量高達（36.77±1.76）%。

超聲波的處理溫度低，與傳統(tǒng)的水提法比較，提取時間短且提取率較高，然而，在使用超聲波提取法時應注意控制時間[15]，超時間的振蕩可能會導致大分子多糖斷裂而影響其生物活性。

1.5 ?微波提取法

微波是頻率介于300 MHz～300 GHz的電磁波，其強大的穿透力可透過細胞壁到達細胞內(nèi)部，使細胞內(nèi)部產(chǎn)生高溫高壓[16]，當壓力超過細胞的承受壓力時，細胞膜和細胞壁就會被破壞而產(chǎn)生微孔或裂紋，細胞內(nèi)的有效成分隨之進入周圍的溶劑中。劉小麗等[17]用微波法提取香菇中多糖，最佳提取時間僅需5 min，其多糖提取率可達9.46%。Zhang等[18]研究不同提取方法對金針菇多糖提取率的影響，發(fā)現(xiàn)微波提取法得到的多糖提取率最高且耗時最少，提取率約比熱水提取法高3%。

微波提取法具有加熱均勻、提取快速等優(yōu)點[19]，可大大縮短提取時間，提取效率高，但該法不適用于熱不穩(wěn)定化合物。

1.6 ?超臨界萃取法

超臨界萃取是以超臨界流體為溶劑，從提取物中萃取有效成分的技術(shù)。超臨界流體既有液體的高溶解性，又有氣體的高擴散性，容易穿進提取物基質(zhì)中[20]，由于CO2的超臨界條件（溫度304.6 ℃，壓力7.38 MPa）容易達到，常被作為超臨界萃取的溶劑。陳明等[21]利用CO2超臨界萃取法提取綠茶多糖，在綠茶粉顆粒度為40目，萃取壓力35 MPa，45 ℃下萃取2 h，綠茶多糖提取率達到了92.50%。

CO2超臨界流體法溶解性好，分析效率高，提取結(jié)束后CO2可減壓回收，不存在殘留問題，該法在天然多糖的提取應用中前景較大。缺點是設(shè)備復雜，運行成本高，提取范圍有限。

比較以上幾種方法可知，多糖的提取方法中，溶劑提取法應用最廣泛（尤其是水提法）;最節(jié)省時間且提取效率高的是微波提取法;對于分子量較大的多糖，用堿提取法較好;而對于半乳糖醛酸含量豐富的多糖，用酸提取法較好;酶解法可以制備相對較純的多糖，但需要解決酶殘留和酶降解物的去除問題;超臨界萃取法保持多糖的生物活性效果最優(yōu)，但該方法運行成本相對較高。

2 ?多糖的分離純化

天然多糖提取之后，常會混合蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)及色素等雜質(zhì)。要得到單一組分，一般要先去除非多糖組分，再進一步對多糖組分進行分離純化[22]。

2.1 ?非多糖組分的去除

由于多糖難溶于有機溶劑，因此，常用乙醇或丙酮進行反復沉淀洗滌，除去一部分醇溶性雜質(zhì)，然后用Sevag法/三氟三氯乙烷法/三氯醋酸法去除游離蛋白質(zhì)，其中Sevag法最為常用。Sevag試劑不影響多糖的結(jié)構(gòu)，可避免多糖的降解，該法溫和，缺點是需要多次反復才能把蛋白質(zhì)除盡。小分子雜質(zhì)的去除可以用透析法，該法操作簡單，技術(shù)成熟，但是周期較長，常溫下操作有可能導致多糖霉變[23]。色素的去除則根據(jù)其不同性質(zhì)采取不同的除色素方法，常見的有離子交換法、氧化法、金屬絡(luò)合物法、吸附法（纖維素、藻土、高嶺土、活性炭）等。

2.2 ?分離純化

雜質(zhì)去除后還需要進一步分離純化，從粗多糖中得到均一的高純度活性多糖組分。分離純化多糖的方法很多，主要有沉淀法、金屬絡(luò)合物法、高效液相色譜法、柱層析法、超濾法和電泳法等。其中比較常用的是柱層析法和高效液相色譜法，本文著重對多糖的柱層析純化法進行綜述。

柱層析法是以固體吸附劑為固定相，以溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種層析方法。其原理是利用吸附劑對混合樣品中各組分的吸附力不同而使各組分分離[24]，當采用溶劑洗脫時，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程，吸附力較強的組分后出柱，吸附力較弱的組分先出柱，根據(jù)出柱順序的不同而達到分離。常用的多糖柱層析純化法有凝膠柱層析法和纖維素陰離子交換柱層析法。

2.2.1 ?凝膠柱層析法 ?凝膠柱層析又稱分子篩過濾或排阻層析，利用凝膠的分子篩作用，根據(jù)多糖分子大小的不同進行分離[25]，常用葡聚糖凝膠（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（Sephacryl）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）為固定相，去離子水或稀鹽溶液為洗脫液。不同的凝膠都有其相對應的相對分子質(zhì)量范圍，試驗前應根據(jù)目標多糖的相對分子質(zhì)量大小選擇合適的凝膠。一般情況下，大分子的先出柱，小分子的后出柱。值得注意的是，凝膠柱層析法不適合于黏多糖的分離。侯慶愛等[26]以海帶為原料，研究了巖藻多糖的提取工藝，其最佳條件為料液比1∶20，溫度80 ℃，提取3次，每次10 h，巖藻多糖得率為25%，經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析純化，純度可達93%。

2.2.2 ?纖維素柱層析法 ?纖維素柱層析法一般用DEAE樹脂作交換劑，適合分離各種酸性多糖、中性多糖和黏多糖，其吸附力隨著活性多糖分子中酸性基團的增加而增加[27]。洗脫劑為不同濃度的堿液、鹽溶液或硼砂等。Popov等[28]以新鮮李子為原料，采用DEAE-纖維素分離純化粗多糖，用NaCl溶液進行等度洗脫，得到2種結(jié)構(gòu)不同的多糖組分。Xu等[29]利用DEAE-52纖維素離子交換層析，從茶花粗多糖中得到鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖等8種單糖。

在實際純化多糖工作中，往往需要綜合應用不同方法才能達到分離純化的效果。Zhang等[30]采用熱水-超聲輔助提取和乙醇沉淀獲得砂仁粗多糖，脫蛋白后經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱層析分離純化得到ASP（砂仁多糖），ASP再經(jīng)Sephadex G-100分離純化得到ASP-1、ASP-2和ASP-3三個組分，經(jīng)氣相色譜法、液相色譜法和紅外光譜鑒定表明其單糖成分為葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等。Wang等[31]分別用瓊脂凝膠Q Sepharose柱層析對土曲霉水溶性粗多糖的截留液進行初步分離，得到的組分再用丙烯葡聚糖凝膠SephacrylS-100柱層析系統(tǒng)進行進一步分離和純化，得到平均相對分子質(zhì)量為18.6 kDa的純化物。

3 ?展望

天然多糖因其豐富的生物活性日益受到重視，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等方面有著較大的應用價值。中國豐富的天然資源為活性多糖的開發(fā)利用提供了得天獨厚的條件，然而由于多糖種類繁多、結(jié)構(gòu)相對復雜、分離純化難度較大等諸多因素，給天然活性多糖的研究和應用帶來了不少的挑戰(zhàn)。運用不同提取方法、分離純化技術(shù)對各種活性多糖進行開發(fā)和比較，仍然是天然活性多糖研究工作的重點。

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