山茱萸多糖提取純化方法及藥理作用研究進(jìn)展

山茱萸多糖提取純化方法及藥理作用研究進(jìn)展

楊雪季紅1劉穎男2張玉成2

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130033)

關(guān)鍵詞〔〕山茱萸多糖；衰老；抗氧化

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：吉林省中醫(yī)藥管理局(08SYS-091，2010-pt050)

通訊作者：張玉成(1978-)，男，博士，醫(yī)師，主要從事腫瘤基因診斷、治療及衰老機(jī)制研究。

1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥品管理部

2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室

第一作者：楊雪(1984-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事圍生醫(yī)學(xué)研究。

山茱萸又叫石棗、藥棗，為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效。本文著重就山茱萸多糖的提取純化方法及山茱萸多糖的藥理作用作一綜述。

1山茱萸多糖的提取純化方法及最佳的提取工藝

1.1傳統(tǒng)提取純化方法主要采取熱水、超聲和乙醇沉淀等。李平等〔1〕將熱水抽提后的山茱萸殘渣用堿提取后，經(jīng)過中和、濃縮、透析、沉淀，然后再經(jīng)過分離和純化，得到白色粉末狀多糖PFCCⅠ，最終證明PFCCⅠ是由木糖和葡萄糖以18.8∶81.2摩爾比組成，平均相對分子質(zhì)量為7.57×104kD。同時該研究者〔2〕用熱水抽提、Sevag法脫蛋白、沉淀、分離，最后再通過純化，最終得到白色粉末狀多糖PFCA Ⅲ。陳汝賢等〔3〕同樣用熱水來提取，去除雜質(zhì)后經(jīng)過乙醇沉淀，利用小型超濾/過濾系統(tǒng)及兩種柱色譜進(jìn)行分離，最終得到多糖組分SZYP-2。趙曉華〔4〕分別應(yīng)用超聲和熱水兩種方法提取山茱萸多糖并進(jìn)行純化，具體方法如下：熱水(超聲)提取，乙醇沉淀，Sevag法除蛋白，經(jīng)過分離純化后，最終得到2種純化多糖S2(超聲提取)和F4(熱水提取)。楊云等〔5〕也采用熱水提取，乙醇沉淀，采用了三氯醋酸除蛋白得到粗多糖，經(jīng)過分離和純化后，高效凝膠滲透色譜鑒定純度并測定分子量等步驟后，最終分離得到一水溶性多糖Co-4，其分子量為2.47×104kD。趙莉等〔6〕采用水抽提，乙醇沉淀，柱層析等方法從山茱萸果實(shí)中分離出兩類多糖，分別為非淀粉類中性糖和酸性多糖，含量分別為7.4%和1.1%。

1.2提取工藝條件張彩瑩等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)在溫度為100℃、時間為3 h、料液比為1：36的條件下，最終山茱萸多糖提取率為199.36 mg/g。趙曉華等〔8〕研究確定了山茱萸多糖的最佳提取工藝，在溫度為80℃、料液比為1∶60、時間為300 min的條件下，最終山茱萸多糖提取率為13.8 %。李平等〔9〕研究也確定了山茱萸多糖最佳提取工藝，該研究發(fā)現(xiàn)在溫度為80 ℃、時間為2 h、料液比為1∶16的條件下，同時原材料粒度采用300～450 μm，提取次數(shù)4次，脫蛋白次數(shù)6次，最終分離得到白色多糖PFCA Ⅲ，該多糖經(jīng)紅外光譜(IR)檢測為含有α糖苷鍵的多糖。

1.3應(yīng)用微波輔助和復(fù)合酶法提取純化山茱萸多糖以及工藝優(yōu)化胡園園等〔10〕采用微波輔助技術(shù)提取山茱萸多糖，發(fā)現(xiàn)在浸泡時間為2 h、微波功率為456 W，材液比為1∶33及微波處理時間為3.2 min的條件下，最終山茱萸多糖提取率為11.12%，從而確定了山茱萸多糖提取的最佳工藝條件。吳艷芳和李豪等〔11，12〕均進(jìn)行了微波輔助技術(shù)提取山茱萸多糖，其中吳艷芳等〔11〕得出的微波輔助提取山茱萸多糖的最佳工藝條件是：料液比為1∶25，微波功率為560 W，微波處理時間為10 min，浸提時間為70 min，最終山茱萸多糖平均提取率為10.53%；李豪等〔12〕發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用以下工藝條件山茱萸多糖得率可達(dá)20.94%：即山茱萸粉末最佳直徑需要在300～450 μm，而料液比1∶19.7，微波功率為624 W，微波處理時間為55 s，水浴溫度為90℃，浸提時間為120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為68.4%。除了微波輔助技術(shù)提取山茱萸多糖外，最近又有文獻(xiàn)顯示應(yīng)用復(fù)合酶法可提取山茱萸多糖。程俊文等〔13〕應(yīng)用復(fù)合酶法提取山茱萸多糖，應(yīng)用的復(fù)合酶包括纖維素酶(2.0%)、果膠酶(2.0%)和中性蛋白酶(1.5%)，最終發(fā)現(xiàn)其提取工藝條件為：浸提時間為69 min，浸提溫度為50℃，pH值為3.8，此時山茱萸多糖最大提取率可為5.54%。

2山茱萸多糖的藥理作用

2.1抗衰老和抗氧化作用目前有關(guān)山茱萸多糖研究最多也是最重要的功能就是其具有抗氧化和抗衰老的作用。例如，歐芹課題組〔14~16〕利用50代人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(HDF)作為衰老模型，以加入山茱萸多糖含藥血清作為處理因素，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖可降低β-半乳糖苷酶含量、p16蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)及DNA損傷率，同時可顯著提高細(xì)胞活力、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4及熱休克蛋白(HSP)70 mRNA表達(dá)，認(rèn)為山茱萸多糖可能通過以下途徑發(fā)揮抗HDF細(xì)胞衰老的作用，即山茱萸多糖可改變細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子，如細(xì)胞周期蛋白D1、P16和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4或者相關(guān)的分子伴侶(如HSP70)等；同時金紅等〔17〕發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖(D-gal)能夠降低D-半乳糖致衰大鼠腦組織丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低單胺氧化酶B(MAO-B)活性及提高小鼠的學(xué)習(xí)能力等，另外，還發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖具有降低膽堿酯酶活性和上調(diào)神經(jīng)生長因子的表達(dá)〔18〕，山茱萸多糖具有提高機(jī)體抗氧化能力，同時上調(diào)老化相關(guān)酶活性發(fā)揮抗腦老化作用，從而提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。張玉成等〔19〕以D-gal致衰小鼠作為衰老模型，以加入大小不同劑量的山茱萸多糖作為實(shí)驗處理因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與衰老組小鼠比較，山茱萸多糖大小劑量組均能明顯降低一氧化氮自由基、一氧化氮合成酶及白細(xì)胞介素(IL)-6，而且能夠顯著提高IL-1和2，山茱萸多糖可能通過降低一氧化氮自由基，提高機(jī)體免疫功能，進(jìn)而起到延緩衰老的作用；李平等〔1，2，20〕研究發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖PFCA I、PFCA Ⅲ均能清除羥基自由基和超氧陰離子自由基，具有抗氧化作用；同時山茱萸多糖能夠顯著提高衰老小鼠血液SOD、過氧化氫酶(CAT)及谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)活力，顯著降低血漿、腦勻漿及肝勻漿中過氧化脂質(zhì)(LOP)水平〔21〕；傅紫琴等〔22〕發(fā)現(xiàn)山茱萸粗多糖能顯著延長腎陰虛模型小鼠負(fù)重游泳時間、耐缺氧時間等。姚運(yùn)香等〔23〕也發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖具有補(bǔ)益肝腎的作用；而且能降低肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平和肝臟組織中MDA含量，具有保護(hù)肝損傷的作用；同時，山茱萸多糖能提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，具有提高小鼠免疫力的功能。以上研究均表明山茱萸重要成分山茱萸多糖具有抗衰老和抗氧化的作用。

2.2對免疫功能的影響研究表明山茱萸既具有增強(qiáng)免疫的功能，又具有抑制免疫的功能，而山茱萸多糖主要起免疫興奮作用。苗明三等〔24〕利用環(huán)磷酰胺腹腔注射于小鼠構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能、溶血素形成、溶血素空斑和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均低于正常小鼠，而應(yīng)用山茱萸多糖后，均可顯著提高以上指標(biāo)。杜偉峰等〔25〕利用相同方法構(gòu)建免疫抑制模型，發(fā)現(xiàn)免疫低下模型小鼠無論是體液免疫、細(xì)胞免疫還是非特異性免疫等比正常小鼠有所降低，而應(yīng)用山茱萸制品多糖后明顯改善以上指標(biāo)。以上研究均表明山茱萸多糖具有提高免疫的作用。

2.3改善骨髓造血楊東旭等〔26〕等利用化療藥物環(huán)磷酰胺腹腔注射于小鼠體內(nèi)，10 d后檢測發(fā)現(xiàn)小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白濃度均有所降低，同時降低的指標(biāo)還有脾臟指數(shù)、骨髓細(xì)胞數(shù)和DNA含量；如果同時應(yīng)用山茱萸多糖作為處理因素，能夠明顯提高白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白濃度及DNA含量和骨髓有核細(xì)胞數(shù)。因此山茱萸多糖可能通過改善骨髓造血，進(jìn)而促進(jìn)各種血細(xì)胞的恢復(fù)。

2.4對腫瘤細(xì)胞的影響現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明山茱萸多糖具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用。鄒品文等〔27〕發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖在體外明顯抑制S180肉瘤細(xì)胞的生長，同時也發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖在體內(nèi)能提高荷S180瘤細(xì)胞的小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)，而降低CD8+T細(xì)胞表達(dá)，提高IL-2、降低IL-4水平。王恩軍等〔28~31〕應(yīng)用山茱萸多糖作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞，山茱萸多糖能夠顯著抑制Hela和A549細(xì)胞的生長，并能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是山茱萸多糖通過降低Survivin和Bcl-2及上調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)。

山茱萸應(yīng)用有著悠久歷史，其作用廣泛，《本草綱目》記載山茱萸具有“強(qiáng)陰益精，安五臟，通九竅，止小便利。久服，明目強(qiáng)身延年。治腦骨痛，療耳鳴，補(bǔ)腎氣，興陽道，堅陰莖，添精髓，止老人尿不節(jié)”。山茱萸具有調(diào)節(jié)免疫、降低血糖、抗炎抑菌、抗衰老、抗心律失常及抗癌等功效。山茱萸成分多而復(fù)雜，主要包括糖類、苷類、有機(jī)酸及其酯類、鞣質(zhì)類及微量元素等。目前關(guān)于其重要成分山茱萸多糖的研究越來越多，其藥理作用主要包括提高免疫、抗炎、抗衰老和抗氧化、提高骨髓造血及抗腫瘤細(xì)胞作用，需進(jìn)一步揭示山茱萸多糖藥理作用及機(jī)制。

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〔2014-02-19修回〕

(編輯趙慧玲/張慧)