CXCR4啟動子報告載體的構建

通信作者：殷小成(1969-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事兒科血液與免疫系統(tǒng)疾病的基礎和臨床研究。E|mail:xcyin108@sina.com

CXCR4啟動子報告載體的構建

王艷1，李丹1，黃可1，殷小成2

(1.惠州市第一婦幼保健院兒科，廣東 惠州 516001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院兒科，湖南 衡陽 421001)

[摘要]目的構建并鑒定含人CXCR4基因啟動子的熒光素酶的報告載體。方法采用克隆人CXCR4基因啟動子的序列，構建報告載體PgL4.17|CXCR4，以其轉染Jurkat細胞，然后測定熒光素酶的活性。結果擴增得到的CXCR4啟動子序列與克隆人PgL4.17|CXCR4的CXCR4啟動子序列和GenBank報道的一致。實驗組熒光素酶的表達活性是874 809.020 0±39 510.624 6，與空白組的465.900 0±26.250 1和對照組的37 981.980 0±2 384.341 2總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4 678.919，P<0.001)。結論按照本實驗方案，含人CXCR4基因啟動子的熒光素酶的PgL4.17|CXCR4報告載體被成功構建。

[關鍵詞]CXCR4啟動子；熒光素酶；報告載體；Jurkat細胞

基金項目：惠州市科技計劃項目(編號：2014Y086)

作者簡介：王艷(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事兒科血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎研究和臨床工作。E|mail:wang13875678120@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.04.002

[中圖分類號]R730.23

收稿日期：(2015-03-19)

Construction of Reporter Vector Containing Human CXCR4Promoter

Wang Yan1,Li Dan1,Huang Ke1,Yin Xiaocheng2

(1.DepartmentofPediatrics,theFirstWomenandChildren’sHospitalofHuizhou,Huizhou516001,China;2.DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,Hengyang421001,China)

Abstract[]ObjectiveTo construct and identify a luciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4 containing human CXCR4 promoter.MethodsThe sequence of CXCR4 promoter gene was cloned,and was inserted into the reporter vector PgL4.17 to construct luciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4,the recombinant plasmids were transfected into Jurkat cells.The luciferase activity was evaluated.ResultsCXCR4 promoter gene fragment was amplified by PCR.The insertion sequence of CXCR4 promoter in the experimental group was 874 809.020 0±39 510.624 6,was 465.900 0±26.250 1 in the blank group,and was 37 981.980 0±2 384.341 2 in the control group (F=4 678.919,P<0.001).ConclusionLuciferase reporter vector PgL4.17|CXCR4 containing human CXCR4 promoter can be constructed successfully.

[Key words]CXCR4promoter; luciferase; reporter vector; Jurkat cells

趨化因子受體CXCR4是基質(zhì)細胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor|1，SDF|1)的惟一受體，SDF|1主要由骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生，兩者特異性結合后在造血系統(tǒng)調(diào)控中起著重要的作用。SDF|1/CXCR4生物軸是指由SDF|1與其特異性受體CXCR4相互作用而構成的一個與細胞間信號轉導、細胞遷移有密切關系的偶聯(lián)分子對，該生物軸不但參與維持正常造血細胞的存活和增殖，而且與惡性細胞的增殖和血液、骨髓、淋巴結的浸潤均有密切的關系[1]。SDF|1/CXCR4生物軸參與多種腫瘤的特異性轉移，尤其在血液腫瘤浸潤的病理過程中具有重要作用，因此，研究SDF|1/CXCR4生物軸已成為目前腫瘤研究的熱點之一。本研究采用含人CXCR4基因啟動子的熒光素酶的PgL4.17|CXCR4表達載體轉染Jurkat細胞，測定其熒光素酶的活性，旨在探討基因重組技術對在以SDF|1/CXCR4生物軸為靶點的急性白血病的發(fā)生發(fā)展中的作用，并為靶向基因治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料人白血病Jurkat細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；E4550熒光素酶盒、熒光素酶報告基因表達載體PgL4.17、pGEM|T Easy克隆載體、dNTP、IPTG、X|gal、GloMax?96微孔檢驗儀均購自美國Promega公司；限制性內(nèi)切酶Kpn I、Nhe I、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Marker DL2000均購自日本TaKaRa公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒均購自Qiagen公司；G418、RPMI1640購自美國Gibco公司。

1.2實驗方法

1.2.1CXCR4啟動子引物合成依照GenBank中FJ642475 CXCR4啟動子序列設計引物，該引物由上海生工生物公司合成，在引物的上游、下游中分別加入Kpn I、Nhe I酶切位點，上游引物為：5’|CGGTACCAAGCACTATTCGCGAATTGGTTAC|3’，下游引物為：5’|TGCTAGCGGTAACCGCTGGTTCTCCAGA|3’。產(chǎn)物大小為876 bp。

1.2.2CXCR4啟動子序列擴增提取健康志愿者靜脈血，分離外周血單個核細胞，提取人正常基因組DNA，以此為模版，采用設計的上下游引物，PCR擴增CXCR4啟動子序列。PCR擴增體系：人基因組DNA 2 μL，高保真Taq酶2 u，上下游引物各0.5 mL，4×dNTP 2 μL，10×buffer 5 μL，去離子水補足50 μL，反應參數(shù)：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃復性30 s、72 ℃延伸40 s，擴增循環(huán)25 次；最后72 ℃延伸5 min。取擴增產(chǎn)物5 μL行20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，256 nm紫外線燈下驗證片段大小。

1.2.3報告載體的構建和鑒定擴增產(chǎn)物和PgL4.17報告基因載體，分別用Kpn I、Nhe I雙酶切(37 ℃，2 h),瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒回收和純化。將純化后的雙粘片段和雙粘的線性質(zhì)粒PgL4.17直接與pGEM|T Easy載體進行連接，16 ℃連接過夜，轉化感受態(tài)細菌DH5α，篩選陽性克隆，獲得陽性報告載體PgL4.17|CXCR4，最后對擴增啟動子片段進行堿基序列測定，鑒定陽性重組子的正確性。

1.2.4Jurkat細胞轉染用體積分數(shù)10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat細胞，將構建的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法分別將PgL4.17、PgL4.17|CXCR4轉入Jurkat細胞,在轉染之前以3×105個/孔的細胞密度接種于24孔板上，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，以濃度為600 mg·L-1G418進行篩選，2周后獲得穩(wěn)定Jurkat細胞轉染株,然后在濃度為200 mg·L-1G418壓力下再擴大培養(yǎng)。

1.2.5實驗分組以未轉染任何質(zhì)粒的Jurkat細胞為空白組，以穩(wěn)定轉染PgL4.17質(zhì)粒的Jurkat細胞為對照組，以穩(wěn)定轉染PgL4.17|CXCR4質(zhì)粒的Jurkat細胞為實驗組，分別以1×106個/孔的細胞濃度接種于6孔板上，每組設5個復孔，參照E4550熒光素酶試劑盒說明，用GloMax?96微孔檢驗儀檢測以上分組螢光酶的熒光值，每孔至少重復3次，然后取平均值得出各組數(shù)值。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，3組螢光酶的熒光素酶活性的比較采用單因素方差分析和LSD|t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1人CXCR 4啟動子序列的擴增結果用設計的引物行PCR擴增，獲得人CXCR4啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段與目的片段理論值876 bp一致。

2.2人CXCR 4啟動子熒光素酶表達載體的鑒定CXCR4啟動子序列克隆入PgL4.17載體，篩選陽性克隆，經(jīng)Kpn I、Nhe I雙切酶電泳，瓊脂糖凝膠電泳結果符合預計大小，DNA測序結果證實PgL4.17|CXCR4的插入序列與設計的完全一致。

2.3各組熒光素酶活性空白組熒光素酶活性為465.900 0±26.250 1，對照組熒光素酶活性為37 981.980 0±2 384.341 2，實驗組熒光素酶活性為874 809.020 0±39 510.624 6，3組總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4 678.919，P<0.001)。實驗組熒光素酶活性高于空白組和對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組熒光素酶活性高于空白組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3討論

CXCR4在急性白血病的原代細胞中均有不同程度的表達，其在急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血病原代細胞均為高表達。國內(nèi)學者曾東風等[2]在檢測血液腫瘤中的相關因子表達中發(fā)現(xiàn)患者外周血SDF|1和骨髓表面CXCR4的表達均高于正常對照組，并且SDF|1、CXCR4之間的表達存在相關性，尤其是在急性淋巴細胞白血病原代細胞中的CXCR4高表達與其髓外浸潤有關。國外學者Crazzolara等[3]在73例兒童急性淋巴細胞白血病的骨髓樣本研究中發(fā)現(xiàn)，伴有髓外浸潤的兒童急性淋巴細胞白血病細胞的CXCR4表達高于無浸潤組，而且以發(fā)生多個部位的髓外浸潤為特征的成熟急性淋巴細胞白血病中的CXCR4表達為最高，因此也認為在急性淋巴細胞白血病細胞中CXCR4呈現(xiàn)高水平表達均預示腫瘤有髓外浸潤的傾向。CXCR4是急性淋巴細胞白血病細胞中檢測到的表達最強的趨化因子受體，CXCR4是SDF|1的惟一受體，尤其是在急性淋巴細胞白血病原代細胞的表達明顯高于正常對照組。

PgL4.17作為熒光素酶的報告基因載體，既不含啟動子，也不含增強子，可以用于定量分析調(diào)節(jié)哺乳動物基因表達的各種因子的活性，并且提供了理論基礎[4-5]?；跓晒馑孛傅鞍踪M用低、靈敏度高、半衰期比較短、檢測時間短、不使用放射性同位素等特點，本實驗采用改建后的PgL4.17載體，利用插入的抗性基因作為篩選標志物，更加有利于篩選哺乳動物細胞基因中穩(wěn)定表達的各種的活性因子。本研究不但成功構建和鑒定了PgL4.17|CXCR4報告載體，而且還證實了重組質(zhì)粒PgL4.17上的多克隆位點；實驗中參照GenBank設計了擴增目的基因片段引物，該引物上下游含有相同的Kpn I、Nhe I 2個酶切位點，實驗顯示這樣目的片段不但可以出現(xiàn)雙粘接頭的形式，而且還可以按照正確的方向插入構建的表達載體。

本研究結果顯示：在構建的表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉染Jurkat細胞后，重組質(zhì)粒上游啟動子序列的將調(diào)節(jié)轉染細胞中的熒光素酶的表達，并且熒光素酶活性可以用來直接反應啟動子的強度。我們分別將PgL4.17、PgL4.17|CXCR4轉染Jurkat細胞，培養(yǎng)后測定熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)轉染PgL4.17|CXCR4的Jurkat細胞較轉染PgL4.17組的Jurkat細胞明顯升高，本實驗成功構建了CXCR4啟動子熒光素酶表達載體，從而為進一步以SDF|1/CXCR4生物軸為靶分子的急性淋巴性白血病的治療提供新的研究思路。

參考文獻：

[1]Juarez J,Bendall L.SDF|1 and CXCR4in normal and malignant hematopoiesis[J].Histol Histopathol,2004,19(1):299-309.

[2]曾東風，孔佩艷，陳幸華，等.SDF|1及其受體CXCR4在急性白血病與淋巴瘤表達的初步研究 [J].中國實驗血液學雜志,2005，13(2)274-277.

[3]Crazzolara R,Kreczy A,Mann G,et al.High expression of the chemokine receptor CXCR4predicts extramedullary organ infiltration in childhood acutelymphoblastic leukaemia[J].Br J Haematol,2001,115(3):545-553.

[4]Li W,Gao L,Wang Y,et al.Enhancement of cortisol|induced 11beta|hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression by interleukin 1beta in cultured human chorionic trophoblast cells[J].Endocrinology,2006，147(5):2490-2495.

[5]Yeung CM,Chan CB,Woo NY,et al.Seabream ghrelin: cDNA cloning,genomic organization and promoter studies[J].J Endocrinol,2006,189(2):365-379.