骨髓間充質(zhì)干細胞治療腦梗死的研究進展

劉新華，曹亦賓

卒中是人類死亡和致殘的主要原因之一，其中缺血性卒中大約占80%[1]。目前，僅有溶栓及介入治療能有效恢復血管再通，但由于有限的治療時間窗，只有少數(shù)患者能夠受益。動物實驗表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植能改善腦缺血后神經(jīng)病學和行為學上的缺失[2]，下面對BMSCs治療腦梗死的研究進展進行綜述。

1 骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性

BMSCs是骨髓中胚層間充質(zhì)中一種成體干細胞，為原始造血細胞生長和分化提供必不可少的骨髓微環(huán)境[3]，參與造血細胞的黏附和歸巢，且具有自我復制及多向分化潛能[4]。經(jīng)過適當?shù)恼T導，BMSCs能夠向軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等中胚層細胞分化[5]；此外，BMSCs能夠分化為神經(jīng)系統(tǒng)細胞，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元樣細胞等[6]。體外培養(yǎng)BMSCs，細胞呈長梭形，細胞表面標志CD73、CD90、CD105、CD44、CD9為高表達，而CD34、CD45、CD11b、CD14、CD19、CD79a表達較少[7]。目前BMSCs已經(jīng)成為細胞替代療法和組織工程學的研究熱點。

2 骨髓間充質(zhì)干細胞在實驗動物腦梗死模型中的研究

據(jù)報道，嚙齒類動物BMSCs對治療動物腦梗死模型有一定療效。Pavlichenko等[8]將鼠BMSCs通過靜脈推注治療永久性大腦中動脈梗死（permanent occlusion of middle cerebral artery，pMCAO）模型大鼠，治療后3 d在梗死區(qū)和對側半球均發(fā)現(xiàn)了BMSCs。該研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，治療組大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成較快，炎癥反應減弱，新生血管增多，室管膜下層梗死體積減少；水迷宮實驗顯示治療14 d后，治療組大鼠行為顯著恢復，而對照組無明顯改變。Keimpema等[9]在建立大鼠pMCAO模型2 h后通過血管推注鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)在腦梗死區(qū)出現(xiàn)移植細胞，而且治療組大鼠梗死面積顯著小于對照組。Liu等[10]利用慢病毒將綠色免疫熒光蛋白及生存素（Survivin，SVV）重組體基因重組至BMSCs內(nèi)基因組，利用重組細胞治療腦梗死大鼠，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠腦梗死區(qū)域血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）含量顯著提高，且梗死體積在治療后4 d比未治療組減少5.2%，治療后14 d發(fā)現(xiàn)，大鼠行為學功能也有顯著改善。Miyamoto等[11]通過移植大鼠BMSCs治療腦梗死大鼠，1周后，發(fā)現(xiàn)BMSCs能促進梗死區(qū)周圍糖代謝，并改善大鼠神經(jīng)功能恢復。

目前，不僅同種異體細胞治療取得不錯效果，利用人BMSCs治療動物腦梗死模型也顯示出了積極的效果。Byun等[12]通過動靜脈兩種途徑于不同時間將人BMSCs用順磁性氧化鐵標記后治療pMCAO模型大鼠，經(jīng)頭部磁共振成像顯示動靜脈兩組的缺血半暗帶低信號分布相似，病理學研究發(fā)現(xiàn)，移植細胞在缺血半暗帶分布最多，建模48 h動脈移植組大鼠缺血半暗帶區(qū)BMSCs較靜脈移植組顯著增多。另外，Heo等[13]也發(fā)現(xiàn)，人BMSCs治療大鼠pMCAO模型后9～25 d，大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分較對照組顯著提高。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞治療腦梗死可能機制

過去神經(jīng)保護性治療多針對挽救神經(jīng)細胞進行，而目前認為腦梗死誘發(fā)的損害是通過多種病理生理機制引起神經(jīng)血管單元整體損害[14]。BMSCs可能通過神經(jīng)再生、突觸產(chǎn)生、分泌神經(jīng)因子、血管新生等機制發(fā)揮治療作用，與促進大腦可塑性的機制有相關性，這些因素能夠修復神經(jīng)血管單元，促進神經(jīng)功能恢復。

3.1 刺激神經(jīng)發(fā)生和突觸形成 側腦室室管膜下區(qū)（subependymal ventricular zone，SVZ）存在祖細胞，能夠分化生成新的神經(jīng)元。動物實驗證明，這種分化功能是SVZ祖細胞特性，并且這種神經(jīng)祖細胞可遷移流動到嗅球并分化為中間神經(jīng)元[15]。缺血缺氧環(huán)境會刺激SVZ祖細胞數(shù)量增加，并且這些祖細胞可分化為新神經(jīng)元，而同種BMSCs移植治療大鼠腦梗死后，其神經(jīng)祖細胞數(shù)量也增多[16]。Klionsky等[17]經(jīng)顱內(nèi)定位移植BMSCs治療大鼠腦梗死，發(fā)現(xiàn)SVZ神經(jīng)干細胞增多，而且新生干細胞的存活率升高，丘腦皮層的電路活動部分恢復，神經(jīng)元和軸突密度顯著增大，此外軸突生長蛋白（axonal growth associated protein-43，GAP-43）含量增多，軸突生長抑制蛋白數(shù)量減少。

3.2 神經(jīng)保護作用 Chen等[18]靜脈推注BMSCs治療腦梗死大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能部分恢復，并從大鼠腦組織提取物中分離出腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、VEGF和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），認為BMSCs能通過分泌這些營養(yǎng)因子增強治療效果。另外，體外培養(yǎng)BMSCs的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿中有低水平的BDNF表達，而經(jīng)靜脈移植BMSCs治療大鼠pMCAO模型后，大鼠腦梗死區(qū)域BDNF表達增加[19]，凋亡細胞減少，內(nèi)源性細胞增殖增多，并且同側半球存活細胞及少突細胞前體細胞的數(shù)量也增多[20]。研究推測BMSCs可能通過促進多種神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌起到神經(jīng)保護作用[21]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)作用 急性pMCAO后免疫調(diào)節(jié)在腦損傷和腦保護中都有重要作用。有動物研究顯示，腦缺血能夠誘導BMSCs的動員，使其遷移至損傷部位發(fā)揮作用，其可能機制是受損組織微環(huán)境出現(xiàn)特定的分子信號，例如基質(zhì)細胞衍生因子-1/配體CXC型趨化因子受體（stromal cell derived factor-1/CXC chemokine receptor 4，SDF-1/CXCR4）軸，使移植后的BMSCs歸巢至缺血組織，發(fā)揮治療作用[22]。還有研究認為BMSCs的免疫調(diào)節(jié)包括抑制T細胞、B細胞、自然殺傷細胞的增殖，同時抑制中性粒細胞的呼吸性爆發(fā)，減少樹突細胞的抗原提呈功能，減弱缺血后的炎癥損傷[23]。另外，有研究顯示BMSCs移植后可促進轉化生長因子-β、HGF、一氧化氮、吲哚胺2，3-雙加氧酶等可溶性因子的產(chǎn)生，通過抑制細胞之間的直接接觸發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。

3.4 細胞因子的作用 腦梗死后缺血區(qū)腦組織炎癥反應會加重腦損傷區(qū)域損傷。動物實驗發(fā)現(xiàn)，同種異體BMSCs靜脈移植治療鼠pMCAO模型，可以通過上調(diào)IL-6和IL-10表達，調(diào)節(jié)大腦內(nèi)微環(huán)境，減少細胞凋亡，發(fā)揮抗炎作用；另外，BMSCs靜脈移植后大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）水平降低，也可以減弱炎癥反應[24]。有研究同時通過動靜脈移植同種BMSCs治療大鼠pMCAO模型，兩種途徑都能夠改善大鼠神經(jīng)功能，但靜脈組VEGF、BDNF、bFGF等細胞因子顯著高于動脈組，推測動脈和靜脈移植BMSCs，其對細胞因子分泌的作用機制可能有所不同[25]。

3.5 刺激新生血管形成 體外培養(yǎng)的BMSCs能夠分泌VEGF和血管生成素-1（angiogenin-1，Ang-1）[26]。VEGF在大腦中有生血管的作用，能激發(fā)未成熟血管的形成。Ang-1在血管的成熟、穩(wěn)定和修復方面都起作用并能促進腦內(nèi)血管的形成。同時Ang-1能阻止外圍血管的滲透，從而可減輕腦梗死后的腦水腫，發(fā)揮抗炎作用[27]。

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是各種細胞經(jīng)低氧預處理后產(chǎn)生的一種關鍵因子，低氧激活缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducing factor 1 alpha，HIF-1α），而后使EPO表達增多，且缺氧時間越長，其HIF-1α含量越多，EPO含量隨之增多，促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）也增多[28]。聯(lián)合應用EPO和BMSCs治療腦梗死，能夠提高VEGF的水平，改善神經(jīng)功能恢復[28]。將EPO基因修飾的BMSCs治療大鼠pMCAO模型也發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)保護因子如BDNF，血小板衍化內(nèi)皮細胞生長因子，HGF，基質(zhì)細胞衍生因子1α（stromal cell derived factor 1 alpha，SDF-1α）和缺血再灌注損傷與轉化生長因子β1表達均有提高，且治療組大鼠神經(jīng)功能恢復較對照組顯著改善[28]。

4 提高骨髓間充質(zhì)干細胞治療效果途徑

動物實驗證實，BMSCs治療腦梗死有一定效果，但由于BMSCs在體內(nèi)存活時間較短，移植后不久大多數(shù)細胞就消失了，所以治療效果有限，為了提高細胞治療效果，國內(nèi)外學者做了大量的實驗進行探索。

4.1 BMSCs的低氧預處理 缺血/低氧預處理各種類型細胞、組織或者器官，其益處已被大量實驗證實[20，29-31]，經(jīng)低氧預處理可以顯著提高移植細胞的存活和再生能力。Luskin等[32]利用低氧預處理的BMSCs治療鼠pMCAO模型，與未低氧處理對照組相比，預處理組再生性營養(yǎng)因子VEGF和BDNF釋放較多；刺激并調(diào)節(jié)干/祖細胞向損傷區(qū)域遷移的SDF-1增多，而其受體CXCR4沒有顯著增多；GAP-43顯著增多，而ROCK Ⅱ和NG2細胞受到抑制減少，這些均有助于促進血管與神經(jīng)的重塑以及腦皮質(zhì)環(huán)路的修復[33]。Wei等[34]的研究顯示，移植前對BMSCs進行低氧預處理治療大鼠pMCAO可以促進BMSCs存活、遷移及歸巢至缺血腦組織區(qū)域。還有研究通過常氧及低氧預處理的BMSCs分別治療腦梗死大鼠模型發(fā)現(xiàn)，兩組的BMSCs在移植后1.5 h均能到達缺血皮層及沉積在血管外，而低氧預處理組有較高水平的與細胞遷移歸巢有關的蛋白表達，包括 CXCR4、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）及MMP-9等。Luskin等也發(fā)現(xiàn)低氧處理BMSCs組比常氧組表現(xiàn)出更強的遷移能力，且低氧能顯著提高移植細胞歸巢至梗死皮層[32]。

4.2 能提高BMSCs存活率的培養(yǎng)皿 在普通的組織培養(yǎng)基中，BMSCs能快速貼壁生長，很難進行神經(jīng)誘導，即使在低附著面的培養(yǎng)基中也僅有8%的BMSCs轉變成神經(jīng)球樣聚合物[35]。最近有研究[36]將高度疏水性的DTOPV放置在細胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)BMSCs，可以見到表面疏水的神經(jīng)元樣細胞生長，移植后見到神經(jīng)干、祖細胞的普遍標記的表達，表明BMSCs有分化為神經(jīng)外胚層的潛能，超低的黏附表面使細胞能夠持久保持球形，提高存活率。

4.3 對BMSCs的基因修飾 Scheibe等[25]將細胞凋亡抑制素與BMSCs結合，或是用抗凋亡基因修飾BMSCs后再進行移植，發(fā)現(xiàn)能有效促進腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復。Fu等[37]用SVV修飾BMSCs后治療腦梗死大鼠發(fā)現(xiàn)能提高BMSCs存活數(shù)量，顯著增強VEGF和bFGF表達，減小大鼠腦梗死面積，改善其神經(jīng)功能。Samoilov等[35]用Ang-1基因修飾BMSCs治療鼠pMCAO，發(fā)現(xiàn)腦損傷區(qū)有較多新生血管形成。解燕春等[38]用慢病毒介導bFGF基因修飾BMSCs后治療大鼠腦梗死模型發(fā)現(xiàn)顯著增加腦梗死灶周圍新生血管數(shù)量并促進大鼠神經(jīng)功能恢復。此外，有人分別利用BDNF基因[19]、VEGF基因[39]、神經(jīng)營養(yǎng)因子基因[40]等修飾BMSCs治療腦梗死動物模型，較單純應用BMSCs，基因修飾組的動物神經(jīng)功能恢復均有所提高。目前對基因修飾BMSCs的動物研究有一定進展，但臨床治療較少，未形成統(tǒng)一的認知。

5 臨床試驗

2005年，Bang等[41]利用自體BMSCs靜脈推注治療美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）在7分以上的腦梗死患者，發(fā)現(xiàn)能改善患者1年后的改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）評分。然而這個研究有一定的局限性，如30例符合入組條件的患者中僅有5例接受細胞治療，明顯少于對照組的人數(shù)；由于移植細胞要在體外大量擴增，首次移植在卒中后第4～5周，第2次移植在第7～9周，移植時間較遲，可能影響了治療效果。此研究隨訪5年，BMSCs治療組與對照組相比死亡率無顯著差異，沒有發(fā)現(xiàn)BMSCs治療有嚴重的不良反應[42]。2009年，Suárez-Monteagudo等[43]利用自身BMSCs治療腦梗死，1年后發(fā)現(xiàn)患者mRS評分降低，且未出現(xiàn)與細胞治療相關的副作用。在Honmou等的實驗中，選取了灰質(zhì)梗死、白質(zhì)梗死以及混合梗死的患者12例，卒中后36～133 d通過靜脈注射BMSCs，未發(fā)現(xiàn)與細胞治療相關的不良反應，細胞治療7 d后磁共振成像顯示實驗組患者腦梗死體積比對照組減少20%[44]。Prasad等[45]的實驗中11例患者同樣未發(fā)現(xiàn)嚴重的不良反應，并且在細胞治療后6個月發(fā)現(xiàn)，7例患者有良好的臨床結局，其mRS評分≤2或者Barthel指數(shù)為75～100分。

BMSCs是一種較容易獲得的干細胞，在動物實驗中證實，移植后不需要使用免疫抑制藥物。但目前還沒有統(tǒng)一的細胞治療方案，如移植細胞的數(shù)量，細胞移植前的準備，移植時間窗等問題還需要進一步研究?？蒲泄ぷ髡咴谔岣連MSCs治療效果方面做了大量研究，但是目前還沒有就某一種方法達成共識，需要進一步就提高療效方面進行探索。此外，細胞移植在有些動物實驗中并未檢測到不良反應，但這種方法是否真的有利無害，科研人員需要進一步探究其可能潛在的短期和長期的毒性反應和副作用。

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