ORMDL3 基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族支氣管哮喘的相關(guān)性研究

楊 婷 崔麗英

支氣管哮喘是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳病，Moffatt 等［1］于2007 年首次通過全基因組關(guān)聯(lián)性研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)位于17 號染色體之上的ORMDL3 (oresomueoid 1 -like protein 3)基因與兒童期哮喘密切相關(guān)。其中位于 ORMDL3 附近的 GSDML 基因上的SNPrs7216389 的與哮喘的相關(guān)性研究已在多個種族、地區(qū)中廣泛開展。近3 年來我國同類相關(guān)研究相繼增多，曾在北京兒童、南方成人等不同年齡組，漢族、海南黎族等不同民族，江西省、山東省、深圳市等不同地域利用全基因組關(guān)聯(lián)性研究、PCR 產(chǎn)物酶切等方法探討ORMDL3 基因多態(tài)性，尤其是rs7216389與哮喘的關(guān)系［2～7］。目前在我國北方少數(shù)民族聚集地區(qū)，如內(nèi)蒙古自治區(qū)的蒙古族人群中關(guān)于ORMDL3基因多態(tài)性與成人哮喘的關(guān)聯(lián)性研究并不多見。本研究嘗試探討該基因與蒙古族哮喘是否相關(guān)。

資料與方法

1.資料:選擇2011 年8 月～2013 年2 月間就診內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，符合3 代及以上直系親屬均為蒙古族血統(tǒng)的成人哮喘確診患者100 例(哮喘組)，診斷標準參考中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組在2008 年制訂的支氣管哮喘防治指南［8］，剔除了患有其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病及其他器質(zhì)性疾病者。男性49 例，女性51 例，患者年齡16 ～70 歲，平均年齡45.00 ±13.64 歲;對照組:健康蒙古族成人100 例，其中男性53 例，女性47 例，患者年齡18 ～67 歲，平均年齡44.66 ±12.78 歲。研究對象年齡、性別構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，進行研究前均取得受試者知情同意。

2.研究方法:(1)DNA 提取及檢測純度:用EDTA 管抽取外周靜脈血2ml，利用血液基因組提取試劑盒(北京天根生物試劑公司)提取DNA，通過紫外分光光度儀(MJ -Research，Inc，美國)檢測其純度。(2)DNA 擴增:通過Primer Premier 軟件設(shè)計目的SNPrs7216389 的引物，序列如下:上游引物:5' -TCTCTCGCTGTTGTTTGTAT-3'，下游引物:5' -CCCTGTAGGTTCCCATCT- 3'，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，PCR 擴 增 反 應(yīng) 體 系(50μl):2 × Taq Master Mix(25μl)、ORMDL3 -F(1.0μl)、ORMDL3 -R(1.0μl)、dNTP (1.0μl)、滅菌無離子水(22μl)，擴增產(chǎn)物443bp，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)25次，72℃過延伸5min。產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V/cm，時間約60min)檢測見圖1。(3)目的基因測序:委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，應(yīng)用DNAMAN軟件、DNASTAR 軟件分析測序文本，得到SNP 位點3 種基因型的分布頻率，應(yīng)用Chromas 軟件分析測序波峰圖譜，觀察SNP 位點的雜合情況，見圖2。

圖1 rs7216389PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.統(tǒng)計學方法:綜合整理所有實驗數(shù)據(jù)后利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，病例組與對照組的等位基因及基因型頻率的差異性分析采用χ2檢驗，多樣本間率的比較采用χ2檢驗，采用Logistic 回歸進行相關(guān)性檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

哮喘組對照組rs7216389 位點的基因型(TT/TC/CC)分別為(43%/39%/18%)與(28%/39%/33%)，等位基因頻率(T/C)分別為(62. 5%/37.5%)與(47.5%/52.5%)。運用χ2檢驗，兩組間基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);等位基因頻率比較亦差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 兩組間rs7216389 位點基因型及等位基因的分布頻率比較［n(%)］

采用Logistic 回歸模型比較兩組間rs7216389 位點不同基因型的致病風險，相對于基因型CC，基因型TT 與TT+TC 均能增加哮喘發(fā)生率，而基因型TC可能與哮喘發(fā)生無關(guān)，詳見表2。

表2 兩組間rs7216389 位點不同基因型的相對危險度的比較

針對ORMDL3 基因的表達可能存在種族、地域差異性，采用χ2檢驗對近幾年國內(nèi)外多篇文獻報道所提出的關(guān)于rs7216389 位點等位基因T、C 的不同的分布頻率之間進行比較(P ＜0.05)，提示ORMDL3基因rs7216389 位點可能存在顯著的種族差異，詳見表3。

表3 多種族、地域的哮喘人群間的rs7216389 位點等位基因頻率比較

討 論

ORMDL3 基因包括6560 個堿基對，包含3 個外顯子，編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的由153 個氨基酸組成的4種跨膜蛋白，其序列高度保守，其表達產(chǎn)物在各組織中廣泛分布，尤其在成人肝臟、胰腺中，在胎兒的肺、肝臟、腎臟、脾臟中呈高水平表達，但具體功能目前還不明確［9，10］。近年來有研究推測該基因產(chǎn)物可能與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)［11］。ORMDL3 蛋白的表達異常以致未折疊蛋白反應(yīng)(URP)而促進炎性反應(yīng)、致脂質(zhì)代謝紊亂而影響細胞功能及參與、影響呼吸道病毒感染等方式致?。?，9，11］。

rs7216389 及其周圍基因為跨種族的高度保守的非編碼區(qū)序列，與促炎性轉(zhuǎn)錄因子C/EBPb 具有高度同源性［12］。有研究表明T 等位基因可顯著增加波多黎各、日本、法籍加拿大、歐洲及墨西哥哮喘人群的患病風險，但是在非裔美洲人中未證實這一點［10］。Tavendale 等［13］在蘇格蘭青年(≤22 歲)人群中發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 與哮喘正相關(guān)，T 等位基因分布頻率越高，發(fā)生率越高。Bisgaard 等［14］在北歐地區(qū)發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 與早期哮喘有關(guān)。Wu 等［15］在墨西哥人群(4 ～17 歲)中發(fā)現(xiàn)rs7216389 -T 能夠顯著增加哮喘的發(fā)病風險。在我國南方地區(qū)、漢族及海南黎族的哮喘人群(包括成人及兒童)中，rs7216389 的基因分布頻率也有顯著差異［3，5］。孫婧等［16］將北京兒童哮喘病的嚴重程度分型后探究與ORMDL3 基因的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)rs7216389 位點與哮喘的嚴重程度密切相關(guān)，其中，T 等位基因的攜帶者發(fā)生重度哮喘的風險更大，這一結(jié)論在英國地區(qū)也得到證實，即rs7216389易于誘發(fā)兒童發(fā)生重度哮喘［17］。

池穎靜等［3］針對南方成人哮喘患者起病年齡的不同分組研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)與晚發(fā)組在ORMDL3 的基因多態(tài)性分布上無明顯差異，從而得出盡管成年患者的起病存在環(huán)境因素的影響，rs7216389 -T 仍可提高哮喘易感性的結(jié)論。此外，崔云霞等［18］通過檢索和薈萃分析的方法分析了6 篇代表性良好的中外相關(guān)文獻，進一步證明了rs7216389 的多態(tài)性與兒童哮喘密切相關(guān)。綜上所述，各種族、地域的哮喘人群中采用不同的研究方法說明rs7216389 與哮喘的相關(guān)性研究重復性較好，但是由于各人群遺傳背景不同、入選病例哮喘分型不同、SNP 間存在連鎖失衡的現(xiàn)象、環(huán)境因素及生活方式的影響、檢測方法各異等原因，致使如上結(jié)論還需要更多重復性驗證。

本研究將哮喘患者中該位點基因型(TT/TC/CC)的分布頻率、等位基因的分布頻率分別與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明rs7216389 與哮喘發(fā)病相關(guān)。相對于基因型CC，基因型TT(OR =0.335，P=0. 007)與基因型TT + TC(OR = 0.446，P =0.016)均能顯著增加哮喘易感性，而基因型TC(OR=0.545，P=0.102)則可能與哮喘無關(guān)。

綜上所述，通過本研究可以發(fā)現(xiàn)攜帶T 等位基因的純合子TT 可能提高哮喘發(fā)生率，而同為攜帶T 等位基因的雜合體TC 及攜帶C 等位基因的純合子CC可能與哮喘無關(guān)，甚至發(fā)揮負效應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)對照組的C 等位基因頻率(52.5%)高于哮喘組(37.5%)，據(jù)此可以推測T 等位基因可能是哮喘的易感基因，而C 等位基因可能是保護基因，這一結(jié)論與Moffatt、Wu等［15］、Tavendale 等［13］、Bisgaard 等［14］及黃漢琮［6］、池穎靜等［3］的發(fā)現(xiàn)是一致的。故rs7216389 及其相鄰基因可以作為重要的遺傳標記，預(yù)測哮喘的發(fā)病可能，為該病的早期診斷提供分子遺傳學依據(jù)。

為了進一步明確SNPrs7216389 的等位基因T、C在多種族人群中的分布頻率有無差異，本研究采用χ2檢驗比較了包括我國內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族在內(nèi)的亞、歐、美洲人種(波多黎各、德國、澳大利亞、墨西哥、日本)間的T、C 等位基因頻率分布，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，這一結(jié)論與Glanter 等關(guān)于rs7216389 -T 與多種族人群的哮喘相關(guān)性差異有統(tǒng)計學意義的結(jié)論是一致的。

1 Mofatt MF，Kabesch M. Genetic variants regulating asthma-associated ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma［J］.Nature，2007，448(7152):470 -473

2 金哲，蔡欣，王強，等.北京地區(qū)哮喘兒童ORMDL3 基因表達水平、生活方式與室內(nèi)空氣質(zhì)量的相關(guān)性研究［J］. 醫(yī)學研究雜志，2010，39(10):22 -25

3 池穎靜，莊建偉，江柳.ORMDL3 基因多態(tài)性與南方成人哮喘發(fā)生的相關(guān)研究［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9(30):1 -3

4 邱熔芳，高貴敏，郭辰虹，等. ORMDL3 基因與漢族人群哮喘的相關(guān)性研究［J］.國際遺傳學雜志，2009，32(4):13 -16

5 丁毅鵬，何海武，石慧芳，等. 海南黎族哮喘ORMDL3 基因多態(tài)性研究［J］.海南醫(yī)學，2012，23(11):1 -2

6 黃漢琮，曾林祥.ORMDL3 基因多態(tài)性與支氣管哮喘發(fā)病及肺功能的相關(guān)性研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(10):780-781

7 盧愛萍，林岳華，張?zhí)K皖等.ORMDL3 基因多態(tài)性在哮喘高?；純褐械难芯浚跩］.醫(yī)學綜述，2012，18(13):2111 -2113

8 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組. 支氣管哮喘防治指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(3):177 -185

9 Hjelmqvist L，Tuson M，Marfany G，et al. ORMDL proteins are a conserved new family of endoplasmic reticulum membrane proteins［J］. Genome Biol，2002，3(6):1 -16

10 Gerard CR，F(xiàn)andos C，F(xiàn)anny RM，et al. The asthma - associated ORMDL3 gene product regulates endoplasmic reticulu-mediated calcium signaling and cellular stress［J］. Human Molecular Genetics，2010，19(1):111 -121

11 Hsu KJ，Turvey SE.Functional analysis of the impact of ORMDL3 expression on inflammation and activation of the unfolded protein response in human airway epithelial cells［J］. Allergy Asthma Clin Immunol，2013，9(1):4

12 Breslow DK，Collins SR，Bodenmiller B，et al. Orm family proteins mediate sphingolipid homeostasis［J］. Nature，2010 463(7284):1048 -1053

13 Tavendale R，Macgregor DF，Mukhopadhyay S，et al. A polymorphism contronlling ORMDL3 expression is associated with asthma that is poorly controlled by current medications［J］. J Allergy Clin Immunol，2008，121(4):860 -863

14 Bisgard H，Bonnelykke K，Sleiman PM，et al. Chromosome17q21 gene variants are associated with asthma and exacerbations but not atopy in early childhood［J］. Am J Respir Crit Care Med，2009，179(3):179 -185

15 Wu H，Romieu I ，Sienra - Monge JJ ，et al. Genetic variation in ORM1 - like3 (ORMDL3)and gasdermin - like (GSDML)and childhood asthma［J］.Allergy，2009 64(4):629 -635

16 孫婧，李喬俊，徐飛，等.兒童哮喘與ORMDL3 基因多態(tài)性關(guān)系的研究［J］.中國康復理論實踐，2010，16(4):361 -363

17 Binia A，Khorasani N，Bhavsar PK，et al. Chromosome 17q21 SNP and Severe Asthma［J］. J Hum Genet，2011，56(1):97 -98

18 崔云霞，張慧姝，師巖，等.ORMDL3 基因SNP 位點rs7216389 多態(tài)性與兒童哮喘易感性關(guān)系的薈萃分析［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2012，46(6):530 -533