不同煎煮時間大黃水提取液對幼年大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

楊 宵，張樹峰，萬慧杰，趙盼盼，佟繼銘

（河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯:陳志宏)

大黃為常用中藥，主要活性成分是蒽醌類化合物，有瀉下攻積、利濕退黃等多種功效[1-2]。大黃臨床應(yīng)用廣泛，能用于減脂減肥、排毒養(yǎng)顏，但國內(nèi)外有報道稱長期服用大黃對肝臟、腎臟以及生殖系統(tǒng)均可造成不同程度的毒性[3]。本研究通過觀察幼年雌性大鼠子宮凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2的表達(dá)情況，探討長期使用大黃對子宮細(xì)胞凋亡的影響及與煎煮時間的關(guān)系，以期為大黃的臨床安全用藥提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:雌性4周齡SD大鼠，體重60-70g，許可證號:SCXK(京)2009-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 藥材與試劑:大黃(批號:20090902），安國市長安中藥材有限公司;兔抗Bcl-2多克隆抗體(批號:YE1116W)、兔抗Bax多克隆抗體(批號:990197W），北京博奧森生物科技有限公司;免疫組化試劑盒(批號:20120813），北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 大黃水煎劑的制備 大黃藥材粉碎后，10倍水浸泡2h，煎煮兩次，每次煎煮10min/30min，合并煎煮液、過濾，40℃減壓濃縮至含生藥量0.4g/ml備用。

1.3 大鼠分組及給藥 70只雌性4周齡SD大鼠隨機分組，每組10只:空白對照(NC)組，水煎(RDA）10min 3個劑量組(0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）和RDA 30min 3 個 劑 量組(0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）。RDA各組大鼠連續(xù)灌胃給予相應(yīng)劑量不同煎煮時間的大黃30d，NC組大鼠灌胃給予等體積的蒸餾水。

1.4 大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)的檢測 大鼠末次給藥后禁食不禁水，24h后麻醉處死，取子宮，10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片。采用SP免疫組化法檢測大鼠子宮Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，一抗1:100稀釋，用PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。采用IPP 6.0軟件測定子宮組織Bcl-2和Bax表達(dá)免疫組化染色的OD值，計算各組OD值的平均值并進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同煎煮時間大黃水提取液對大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 RDA 10min 0.5、1.0、2.0g/kg 劑量組和RDA 30min 2.0g/kg劑量組大鼠子宮Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著低于NC組，Bax蛋白的表達(dá)水平明顯高于NC組(P＜0.05）。見附表:

附表 大鼠子宮Bcl-2和Bax的表達(dá)情況（±s，n=10）

附表 大鼠子宮Bcl-2和Bax的表達(dá)情況（±s，n=10）

與NC組比較:aP＜0.05;與相同煎煮時間0.5g/kg劑量組比較:bP＜0.05；與RAD 30min 0.5g/kg劑量組比較:cP＜0.05，與RAD 30min 1.0g/kg劑量組比較:dP＜0.05，與RAD 30min 2.0g/kg劑量組比較:eP＜0.05

組別 Bcl-2(OD值） Bax(OD值）NC 組 0.331±0.041 0.126±0.042 RAD 10min 0.5g/kg 0.231±0.033ac 0.207±0.044ac 1.0g/kg 0.187±0.043abd 0.297±0.042abd 2.0g/kg 0.159±0.052abe 0.341±0.039abe 0.5g/kg 0.309±0.043 0.147±0.033 1.0g/kg 0.281±0.053 0.166±0.036 2.0g/kg 0.219±0.035ab 0.233±0.051ab RAD 30min

2.2 相同煎煮時間不同劑量大黃水提取液對大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 大黃煎煮10min，1.0g/kg、2.0g/kg組大鼠子宮Bcl-2的表達(dá)明顯低于0.5g/kg組、Bax的表達(dá)明顯高于0.5g/kg組(P＜0.05）。大黃煎煮30min，2.0g/kg組大鼠子宮Bcl-2的表達(dá)明顯低于0.5g/kg組、Bax的表達(dá)明顯高于0.5g/kg組(P＜0.05）。見附表。

2.3 不同煎煮時間相同劑量大黃水提取液對大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 大黃煎煮10min 3個劑量組大鼠子宮Bcl-2的表達(dá)均低于大黃煎煮30min相同劑量組，Bax的表達(dá)明顯高于大黃煎煮30min相同劑量組(P＜0.05）。見附表。

3 討論

凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡起著關(guān)鍵作用，決定細(xì)胞的狀態(tài)[4-5]。Bcl-2和Bax是最具代表性的一對凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，Bax是其同源基因，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用從而影響細(xì)胞生存，二者的比值決定了細(xì)胞的“命運”[6-7]。當(dāng)Bcl-2和Bax的比值過高或過低時，細(xì)胞將發(fā)生異常增生或者凋亡[8-10]。

本研究采用免疫組化法觀察了大鼠子宮Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，不同煎煮時間和不同劑量大黃水提取液對雌性幼年大鼠子宮Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)有不同程度的影響。水煎10min各劑量組對大鼠子宮Bcl-2和Bax表達(dá)均有明顯影響，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，其中水煎10min 2.0g/kg劑量組大鼠子宮Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的變化最為明顯。而煎煮30min只有2.0g/kg劑量組對幼鼠子宮Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)有明顯影響;并且，水煎30min各劑量組大鼠子宮Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于、Bax蛋白表達(dá)明顯低于水煎10min各劑量組。本研究提示，煎煮10min大黃水提取液可明顯促進(jìn)雌性幼年大鼠子宮細(xì)胞的凋亡;而隨著煎煮時間的延長，大黃水提取液對子宮的促凋亡作用減弱，但具體機制有待于深入研究探討。

綜上所述，大黃水提取液可促進(jìn)雌性幼年大鼠子宮細(xì)胞凋亡，影響程度與煎煮時間以及給藥劑量有關(guān)，其中水煎30min大黃水提取液對雌性幼年大鼠子宮的促凋亡作用較水煎10min明顯減弱。

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