心肺復(fù)蘇對(duì)室顫大鼠腦線粒體功能保護(hù)作用的研究

羅燕玲 蔣龍?jiān)?符岳

心跳驟停是臨床常見的急危重癥，心跳驟停后心肺復(fù)蘇初期自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)成功的患者存活率低，只有1.4%～5%能相對(duì)正常生存出院[1]。在發(fā)生心跳驟停時(shí)，心臟血供完全中斷，予以高質(zhì)量的CPR后，也僅能提供正常心肌血流灌注水平的10%～20%[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過電刺激致顫法建立大鼠心肺復(fù)蘇模型，從線粒體水平研究全腦缺血后CPR對(duì)缺血缺氧后腦功能的保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：scxk粵2004-0011)的SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重450～550 g。

二、方法

1.動(dòng)物準(zhǔn)備與腦線粒體的分離： 應(yīng)用心搏驟停和心肺復(fù)蘇裝置[4-5]建立大鼠心跳驟停與心肺復(fù)蘇模型。 成年健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為3 組，每組8只大鼠。SD大鼠術(shù)前晚禁食，予戊巴比妥鈉濃度(45 mg/kg) 腹腔內(nèi)麻醉，備皮，仰臥位固定，經(jīng)口直視插入氣管鞘管。左股動(dòng)脈置入23-0 PE-50 聚乙烯管監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈壓，右頸靜脈置3F 鞘管送入前端彎曲的指引鋼絲到達(dá)右心室內(nèi)膜，皮下插入針頭形成回路。對(duì)照組僅行麻醉，氣管插管，動(dòng)靜脈置管，不誘導(dǎo)室顫。缺血組大鼠誘發(fā)室顫15 min，不行心肺復(fù)蘇(CPR)。CPR組：室顫誘發(fā)心臟驟停10 min，行5 min心肺復(fù)蘇。15 min后處死各組大鼠，斷頸取頭，分離出海馬組織。按1∶10 體積加入線粒體分離介質(zhì)，勻漿10 次至無腦組織塊。800 g 低溫離心4 min，取上清液；再以16 000 g 低溫離心15 min，棄上清，沉淀即為提取的線粒體。

2.檢測(cè)指標(biāo)： 采用Clark 氧電極法測(cè)定線粒體呼吸功能。反應(yīng)槽內(nèi)加入2．5 mL反應(yīng)介質(zhì)，充分?jǐn)嚢枋够A(chǔ)氧濃度達(dá)到240 nmol/mL 穩(wěn)定狀態(tài)，加入約2mg線粒體懸液孵育1 min，加入20 μL約4 mmol 琥珀酸二鈉，測(cè)得的氧消耗率為Ⅳ態(tài)呼吸(R4)。再加入20 μL 二磷酸腺苷， 測(cè)得氧消耗率為Ⅲ 態(tài)呼吸(R3)。線粒體呼吸控制率(RCR)=R3/R4。液氮凍存海馬神經(jīng)元線粒體通過效液相色譜檢測(cè)磷酸肌酸(PCr)、三磷酸腺苷(ATP)和乳酸(Lac)含量。經(jīng)固定，脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后等處理后置于電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)并記錄圖像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠生理參數(shù)的比較

對(duì)照組、缺血組和CPR組的大鼠的基礎(chǔ)體質(zhì)量、復(fù)蘇前心率、平均動(dòng)脈壓MAP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組、缺血組和CPR組大鼠生理參數(shù)比較

二、線粒體呼吸功能比較

Clark 氧電極測(cè)定呼吸功能結(jié)果顯示，缺血組和CPR 組大鼠腦組織線粒體呼吸功能均較對(duì)照組明顯下降，主要表現(xiàn)為R3 和RCR 值顯著降低(P<0.05)；但CPR組的R3 和RCR 高于缺血組(P<0.05)。見表2。

表2 對(duì)照組、缺血組和CPR組大鼠海馬組織線粒體呼吸功能比較

注:R3、R4單位：nmol/L·min-1·mg-1。與對(duì)照組比較：bP<0.05，aP<0.01；與缺血組比較:cP<0.05

三、能量代謝(PCr、ATP、乳酸含量)比較

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺血組和CPR組的海馬和皮層組織PCr和ATP含量均有不同程度下降(P<0.01)，其中缺血組PCr和 ATP含量的下降幅度更為明顯；缺血組和CPR組乳酸濃度與對(duì)照組相比有所升高(P<0.01)，其中缺血組升高幅度更為明顯(P<0.01)。見表3。

表3 對(duì)照組、缺血組和CPRZ組腦組織能量物質(zhì)(PCr、ATP)和乳酸(Lac)含量

注:與對(duì)照組比較:aP<0.01；與缺血組比較:bP<0.01

四、腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

3組大鼠腦組織線粒體內(nèi)細(xì)胞胞體及細(xì)胞器無明顯腫脹，胞核圓形透明，核仁都比較明顯；線粒體結(jié)構(gòu)比較完整，排列整齊，嵴豐富；核糖體豐富，基質(zhì)密度均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰明朗，形態(tài)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

討 論

腦是人體各器官中對(duì)氧的需求最大的器官，腦的重量只占體重的2%，而耗氧量占人體總耗氧量的20%～30%，心臟輸出血量的15%都供給了腦。心跳驟停后CPR過程本質(zhì)上是全身缺血再灌注的過程，隨之引起廣泛的器官損傷，稱之為“心跳驟停后綜合征”，主要包括腦損傷，心肌功能障礙，全身性缺血再灌注反應(yīng)及持續(xù)誘因性病變[6]。在發(fā)生心跳驟停時(shí)，心臟血供完全中斷，此時(shí)“高質(zhì)量持續(xù)CPR”[7]在提高重要臟器再灌注血流水平就顯得非常重要。

圖1 大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu) 注：A.對(duì)照組;B.缺血組;C.CPR組

線粒體是糖類、脂肪和氨基酸等物質(zhì)最終氧化釋能的場(chǎng)所[8]，這些物質(zhì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)中，參加三羧酸循環(huán)過程中釋放的能量，生成高能化合物ATP。線粒體中還存在著電子傳遞系統(tǒng)，調(diào)控著細(xì)胞各種能量物質(zhì)代謝過程。線粒體呼吸控制率(RCR)是指R3呼吸與R4呼吸之比，是評(píng)價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)完整性及氧化磷酸化偶聯(lián)程度的敏感指標(biāo)，反映了線粒體氧化磷酸化效率[9]。

本研究的結(jié)果顯示,CPR組在室顫10 min后進(jìn)行5 min有效CPR，其腦組織線粒體態(tài)Ⅲ呼吸速率和呼吸控制率比單純15 min缺血組的損傷明顯較輕(P<0.05)。CPR組中PCr和ATP含量較對(duì)照組有所下降，與缺血組相比卻保持在較高水平，乳酸含量也比缺血組降低。通過電鏡分析，心跳驟停15 min后，腦神經(jīng)元細(xì)胞體及細(xì)胞器無明顯腫脹，胞核圓形透明，核仁明顯，線粒體結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，嵴豐富，基質(zhì)電子密度均勻，核糖體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。這結(jié)果提示我們，心跳驟停早期，線粒體損傷以功能性為主，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并不明顯；也提示我們，在心跳驟停后早期盡快實(shí)行高質(zhì)量的CPR，并早期開始高級(jí)生命支持，尤其是以腦功能恢復(fù)為目的的復(fù)蘇措施有重要意義。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，心跳驟停5 min后腦損傷將是不可逆性的。而本實(shí)驗(yàn)觀察到心跳驟停后15 min腦線粒體超微結(jié)構(gòu)改變不明顯，只表現(xiàn)為能量代謝障礙，經(jīng)過有效的CPR可以改善線粒體的功能障礙，提示通過調(diào)節(jié)線粒體功能的措施應(yīng)該是潛在有希望的腦復(fù)蘇治療新靶點(diǎn)。目前，關(guān)于心跳驟停后全腦缺血損傷機(jī)制仍缺乏全面深入的了解，而目前證實(shí)有效的腦復(fù)蘇措施低溫治療在臨床中并沒有廣泛合理的推廣應(yīng)用，所以我們應(yīng)該規(guī)范治療流程同時(shí)進(jìn)一步尋求有效的腦復(fù)蘇措施。

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