樹莓果粉對I 型糖尿病大鼠血糖、免疫反應及氧化應激的影響

楊永晶，韓麗娟，孟 晶，索有瑞，常 珊，楊永棟

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2 中國科學院大學研究生院，北京 100049;3 青海大學農(nóng)林科學院，西寧 810001;4 青?，幊厣锟萍加邢薰荆| 810599;5 青海省康樂醫(yī)院，西寧 810000

I 型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病，是一種由于機體產(chǎn)生異常自身免疫應答破壞胰島β 細胞，使胰島素分泌絕對減少所致的自身免疫代謝性疾?。?］。這種復雜的異常自身免疫應答的發(fā)生機制尚不清楚，但多種研究證實胰島β 細胞損傷與多種免疫細胞和炎癥因子有關，包括T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素(IL)等［2］。此外，氧化應激在糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展中也扮演著重要角色［3］。異常自身免疫應答產(chǎn)生的自由基對胰島β細胞亦具有極大地破壞作用。

皮下注射胰島素一直是治療Ⅰ型糖尿病的最主要手段，這種方法雖然能控制臨床癥狀，卻不能緩解胰島β 細胞的損傷［4］。此外，臨床上也嘗試應用廣譜免疫抑制劑如環(huán)孢霉素、咪唑硫嘌呤、強的松以及抗胸腺細胞的免疫球蛋白等來治療Ⅰ型糖尿病。但隨著治療時間的增長，這種免疫治療會產(chǎn)生嚴重的免疫抑制［5］，給病人帶來極大的痛苦。

樹莓(Rubus idaeusL.)為薔薇科懸鉤子屬植物，又名覆盆子、山莓、牛奶泡等。樹莓主要分布于北半球溫帶和寒帶。近年來，隨著廣泛的人工培育、引種和種植，目前已有幾百個樹莓品種。樹莓果實為多漿小聚合果，味甜微酸，營養(yǎng)豐富，其中含有大量的維生素、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸等。此外，樹莓果實中還含有多糖、有機酸、黃酮、花青素、多酚、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等多種生物活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，樹莓具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗癌、抗疲勞等多種活性［6，7］，具有極高醫(yī)療保健作用，被譽為“黃金水果”。本研究采用鏈脲霉素(Streptozotocin，STZ)誘導的大鼠模型來研究樹莓果粉在Ⅰ型糖尿病中降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化的活性。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD 大鼠60 只，雄性，體重170～190 g，購自甘肅中醫(yī)學院［動物合格證號為:SYXK(甘)2011-0001］。

1.2 實驗材料

樹莓冷凍果(品種:Heritage 哈瑞太茲)，購自青?，幊厣锟萍加邢薰?。鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)購自北京中生瑞泰科技有限公司。格列本脲片(glibenclamide，山西云鵬制藥，批號為:A130801)購自同仁堂大藥房。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒;免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM，細胞因子白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)以及CD4、CD8 分子酶聯(lián)免疫測試盒均購自南京建成生物工程研究所。其他試劑購自青海天順化學試劑公司，均為分析純。

1.3 實驗儀器

血糖測試儀及血糖試紙(三諾，天士力大藥房)、渦旋混合儀(TD-RS-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9203A，上海一恒科技有限公司)、高速連續(xù)型超微粉碎機(CLF-30B，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)、恒溫水浴鍋(DZKW-D-4，河南鄭州南北儀器設備有限公司)、酶標儀(RT-6000，北京裕天醫(yī)療技術)、組織勻漿儀(FSH-2A，金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

2 實驗方法

2.1 樹莓果粉及果粉混懸液的制備

將樹莓冷凍果置于電熱恒溫鼓風干燥箱中除去水分(溫度55 ℃)。用超微粉碎機粉碎樹莓干果(轉(zhuǎn)速22000 rpm，時間1～2 s)后過80 目篩網(wǎng)(孔徑0.2 mm)，除去完好無損的樹莓籽，即得到樹莓果粉。灌胃給藥前，稱取一定量的樹莓果粉置于純水中，于渦旋混合儀上混合數(shù)次制成均勻的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 大鼠糖尿病模型的制備及給藥方法

SD 大鼠先進行一周的適應性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件如下:室溫22 ±2 ℃，相對濕度45 ±5%，使其自由飲水和進食。造模前，大鼠尾靜脈采血，測血糖，稱體重。之后禁食12 h，在大鼠空腹狀態(tài)下按60 mg/kg的濃度一次性腹腔注射STZ(將STZ 溶于pH4.2 的0.1 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液。為防止STZ 降解，必須在避光條件下配置和注射)。96 h 后尾靜脈采血測血糖，血糖值≥16.8 mmol/L 的大鼠即被認定為糖尿病大鼠。將糖尿病大鼠隨機分為4 組，每組10 只，分別為模型組、陽性對照組、樹莓果粉低劑量組和樹莓果粉高劑量組。另取10 只同批健康大鼠作為正常組。大鼠分組當天稱體重并給藥，給藥方式及劑量如下:正常組和模型組大鼠:純水;陽性對照組:格列本脲片20 mg/kg;樹莓果粉低劑量組:樹莓果粉混懸液750 mg/kg;樹莓果粉高劑量組:樹莓果粉混懸液1500 mg/kg。給藥方式均為灌胃，連續(xù)給藥20 d，每5 d 測量血糖并稱體重。

2.3 生化指標的測定

實驗第21 d，大鼠腹腔注射水合氯醛溶液全身麻醉，經(jīng)頸總動脈插管收集血液，并于3000 rpm 4℃離心10 min 獲取血清樣本。將血清樣本按50 μL分裝后于-80 ℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆?。將收集過血液的大鼠脫頸椎處死，收集胰腺組織樣本。將一部分胰腺組織樣本浸泡于10%甲醛溶液中固定，用于組織病理學研究，另一部分樣本于-80 ℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

將胰腺組織稱重，在冰浴條件下用事先預冷的勻漿介質(zhì)(pH7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L 蔗糖，0.8%氯化鈉溶液)制成10%勻漿液。3000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清。依照測試盒說明書測定上清液中MDA、SOD、GSH 的含量。

血清中MDA、SOD、GSH 以及血清中免疫指標IgG、IgA、IgE、IgM、IL-2、INF-γ、TNF-α、CD4、CD8 的測定均依照測試盒說明書進行。

2.4 組織病理學研究

將固定好的組織經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片貼片，二甲苯脫蠟，HE 染色，脫水透明，封固后于光學顯微鏡下觀察并拍照。

3 實驗結(jié)果

3.1 樹莓果粉對STZ 所致糖尿病大鼠基本體征的影響

造模后各組糖尿病大鼠的體重較正常大鼠均明顯下降，墊料較正常大鼠的潮濕，符合糖尿病的基本體征，這也從另一方面說明此糖尿病模型是成功的。正常大鼠毛色有光澤，墊料干燥，體重穩(wěn)步增長。模型組大鼠毛色枯槁，輕度脫毛，墊料潮濕，體重下降明顯。各給藥組大鼠毛色較模型組好，墊料潮濕情況較模型組有所減輕。體重下降情況較模型組明顯緩解，其中陽性對照組大鼠的體重與模型組相比有顯著性差異(*P＜0.05vs模型組)，樹莓果粉高低劑量組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(＊＊P＜0.01vs模型組)。此結(jié)果說明樹莓果粉能明顯緩解糖尿病所致的體重下降(如圖1)。

圖1 樹莓果粉對糖尿病大鼠體重的影響Fig.1 Effect of RPP on the body weight of STZ-induced diabetic rats

3.2 樹莓果粉對STZ 所致糖尿病大鼠血糖的影響

造模后，正常大鼠的血糖無明顯變化，而各組糖尿病大鼠血糖與正常大鼠相比均明顯升高。但隨著治療的進行，情況出現(xiàn)明顯扭轉(zhuǎn)。給藥最后一天，各給藥組大鼠的血糖與模型組相比均有極顯著的下降(＊＊P＜0.01vs模型組)，且樹莓果粉的降血糖作用隨劑量的增加而增強，其中樹莓果粉高劑量組給藥最后一天的效果與陽性藥格列本脲片相當(見圖2)。

圖2 樹莓果粉對糖尿病大鼠血糖的影響Fig.2 Effect of RPP on the blood glucose of STZ-induced diabetic rats

3.3 樹莓果粉對STZ 致糖尿病大鼠胰腺的影響

通過胰腺的組織病理切片可以看出，正常大鼠胰腺組織中的胰島形態(tài)規(guī)則，且均勻分布著大量胰島β 細胞。相比之下，模型組大鼠胰腺組織中的胰島由于受到STZ 的破壞而嚴重損傷，形態(tài)扭曲，胰島β 細胞數(shù)量銳減，且出現(xiàn)凋亡或壞死。給藥后，陽性對照組以及樹莓果粉組大鼠的胰島與模型組相比均有明顯的恢復，主要表現(xiàn)為胰島細胞形態(tài)的規(guī)則化和胰島β 細胞數(shù)量的增加。說明樹莓果粉能一定程度地修復STZ 對胰島造成的損傷(如圖3)。

圖3 糖尿病大鼠的胰腺組織病理學分析(400 ×)Fig.3 Histopathologic examination of pancreas in STZ-induced diabetic rats (H＆E stain，400 ×)

3.4 樹莓果粉對糖尿病大鼠的免疫調(diào)節(jié)

3.4.1 樹莓果粉對STZ 所致的糖尿病大鼠血清中CD4、CD8 分子的影響

如圖4 所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中CD4 和CD8 分子的濃度極顯著升高(##P＜0.01vs常組)。在樹莓果粉的作用下，糖尿病大鼠血清中CD4 分子的濃度較模型組顯著性下降(*P＜0.05vs模型組)，CD8 分子的濃度與模型組相比極顯著性地下降(＊＊P＜0.01vs模型組)。而陽性對照組大鼠血清中CD4 和CD8 分子的濃度較模型組無明顯改變。

圖4 樹莓果粉對糖尿病大鼠血清中CD4、CD8 分子的影響Fig.4 Effects of RPP on the levels of CD4 and CD8 in serum of STZ-induced diabetic rats

3.4.2 樹莓果粉對STZ 所致的糖尿病大鼠血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ 的影響

如圖5 所示，模型組大鼠血清中IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的含量較正常大鼠急劇增加(##P＜0.01vs正常組)，而樹莓果粉則明顯減弱了這一趨勢。樹莓果粉高、低劑量組大鼠血清中的IL-2、TNF-α 和IFNγ 較模型組均顯著下降(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)，且呈現(xiàn)劑量依賴關系。陽性對照組大鼠血清中IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的含量與模型組相比無明顯改變。

圖5 樹莓果粉對糖尿病大鼠血清中TNF-α、IFN-γ 和IL-2 的影響Fig.5 Effects of RPP on the concentrations of TNF-α，IFNγ and IL-2 in serum of STZ-induced diabetic rats

3.4.3 樹莓果粉對STZ 所致的糖尿病大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM 的影響

圖6 為各組大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgE 和IgM 的含量，可以看出模型組大鼠血清中4種免疫球蛋白與正常大鼠相比具有極顯著的增加(##P＜0.01vs正常組)。樹莓果粉對糖尿病大鼠血清中IgM 無明顯影響，與模型組相比無顯著性差異。但樹莓果粉能顯著降低糖尿病大鼠血清中IgG、IgA和IgE 的濃度(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)，且呈現(xiàn)劑量依賴關系。陽性對照組大鼠血清中IgG、IgA、IgE 和IgM 的含量與模型組相比均無明顯改變。

圖6 樹莓果粉對糖尿病大鼠血清中IgG、IgA、IgE 和IgM 含量的影響Fig.6 Effects of RPP on the concentrations of IgG，IgA，IgE and IgM in serum of STZ-induced diabetic rats

3.5 樹莓果粉對STZ 所致糖尿病大鼠血清、胰腺中SOD、GSH 和MDA 的影響

如圖7 所示，模型組大鼠胰腺和血清中的SOD活性和GSH 含量與正常組相比明顯下降，而MDA的含量較正常組顯著上升(##P＜0.01vs正常組)。格列本脲與樹莓果粉均能明顯增加糖尿病大鼠胰腺和血清中的SOD 的活性和GSH 含量，并降低MDA的含量(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)。樹莓果粉的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖7 樹莓果粉對糖尿病大鼠胰腺和血清中SOD、GSH 和MDA 的影響Fig.7 Effects of RPP on SOD，GSH and MDA in pancreas and serum of STZ-induced diabetic rats

4 討論

STZ 是一種天然化學物質(zhì)，現(xiàn)已被廣泛應用于Ⅰ型糖尿病動物模型的建立中。STZ 能特異性地損傷分泌胰島素的胰島β 細胞，并引起導致Ⅰ型糖尿病的自身免疫反應，且模型的臨床表現(xiàn)與組織病理同人類的Ⅰ型糖尿病極為相似［8，9］。此外，STZ 誘導的糖尿病模型還具有氧化應激的特點，這正是其他糖尿病模型所缺乏的［10］。因此，本研究采用STZ 誘導的大鼠模型來研究樹莓果粉在Ⅰ型糖尿病中降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化的活性。

Ⅰ型糖尿病的臨床表現(xiàn)為典型的“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿和體重下降，并伴有血糖及尿糖的升高。在本研究中，樹莓果粉能增加糖尿病大鼠的體重，降低其血糖，并對糖尿病大鼠受損的胰島有一定的修復作用，顯示出了較好的治療Ⅰ型糖尿病的活性。

胰島β 細胞的損傷是由機體異常的自身免疫反應導致的。這種復雜的自身免疫過程是由多種免疫細胞、細胞因子協(xié)同作用完成的，其過程大致如下:負責β 細胞抗原遞呈的巨噬細胞和樹突細胞激活CD4+T 淋巴細胞，巨噬細胞釋放的IL-12 能刺激CD4+T 淋巴細胞分泌IFN-γ 和IL-2。IFN-γ 進一步激活其余巨噬細胞并使其依次釋放IL-1β、TNF-α 以及自由基等，這些對β 細胞都會造成極大的損傷。此外，CD4+T 淋巴細胞分泌的細胞因子能協(xié)助CD8+T 淋巴細胞和B 淋巴細胞與抗原遞呈細胞相互作用。最終，CD8+T 淋巴細胞直接攻擊攜帶目標抗原的β 細胞，造成β 細胞嚴重損傷甚至裂解［11，12］。外周血中的CD4 和CD8 分子是CD4+與CD8+的可溶形式，它們被認為是T 淋巴細胞被激活的重要標志［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，樹莓果粉能明顯降低糖尿病大鼠血清中CD4 和CD8 分子的含量，說明樹莓果粉能減緩T 淋巴細胞的激活。此外，樹莓果粉還能降低糖尿病大鼠血清中IFN-γ、IL-2 以及TNF-α的濃度。雖然B 淋巴細胞及其所產(chǎn)生的多種免疫球蛋白在Ⅰ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過程中作用尚不明確，但本研究發(fā)現(xiàn)樹莓果粉對糖尿病大鼠血清中的IgG、IgA 和IgE 存在一定的影響。以上結(jié)果說明，樹莓果粉能減緩Ⅰ型糖尿病大鼠自身免疫反應的程度，從而減少了胰島β 細胞的損傷。而本研究中的陽性藥對以上免疫指標未產(chǎn)生明顯影響。原因是格列本脲片是通過刺激胰腺胰島細胞分泌胰島素，抑制肝糖原分解和糖原異生作用以及增加胰外組織對胰島素的敏感性來達到降血糖作用的，其并沒有免疫調(diào)節(jié)的活性。

氧化應激也是胰島β 細胞受損的重要因素之一。MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的不斷積累會破壞細胞膜結(jié)構，并引起細胞的代謝障礙產(chǎn)生細胞毒作用［14］。MDA 含量能間接反映細胞的損傷程度。SOD 是清除氧自由基的主要酶，能保護細胞免受氧化應激的傷害。GSH 是由蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種自由基清除劑。SOD 和GHS 在機體的自由基平衡中均具有重要作用，它們的含量能間接反映機體抗氧化損傷和清除氧自由基的能力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，樹莓果粉能顯著增強糖尿病大鼠胰腺和血清中的SOD 活性，增加GSH 含量，并明顯降低MDA 的含量，說明樹莓果粉能很好地改善胰島β 細胞的氧化應激狀況，從而緩解β 細胞的損傷。

綜上所述，樹莓果粉顯示出了良好的治療Ⅰ型糖尿病的活性，且其能通過減緩Ⅰ型糖尿病大鼠自身免疫反應的程度和改善氧化應激狀況來緩解胰島β 細胞的損傷。此研究為樹莓的進一步開發(fā)和利用提供了堅實的實驗基礎和科學依據(jù)。

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