矮垂頭菊乙醇提取物的體外自由基清除活性及其對(duì)高原缺氧小鼠的保護(hù)作用研究

景臨林，馬慧萍，樊鵬程，何 蕾，賈正平

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科 全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050

矮垂頭菊(Cremanthodium humileMaxim)是菊科垂頭菊屬的多年生草本植物，生長(zhǎng)于海拔2400～5600 m 的高山草甸和碎石區(qū)，主要分布于西藏、青海、甘肅和云南等地［1］。傳統(tǒng)藏醫(yī)理論認(rèn)為矮垂頭菊具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕的功效［1］。最新研究發(fā)現(xiàn)矮垂頭菊還具有一定的抗腫瘤活性［2］。課題組前期對(duì)多種青藏高原植物篩選發(fā)現(xiàn)，矮垂頭菊具有一定的抗缺氧活性［3］。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)矮垂頭菊乙醇提取物的總黃酮和總多酚的含量、體外自由基清除活性及其對(duì)缺氧小鼠保護(hù)作用進(jìn)行研究，從抗氧化的角度闡明其抗缺氧作用機(jī)制，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)成為抗高原缺氧藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物

矮垂頭菊購(gòu)自青海西寧三江寶商貿(mào)有限公司，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所楊永建教授鑒定為菊科垂頭菊屬Cremanthodium humileMaxim 的花;干燥的矮垂頭菊200 g，粉碎后加入10 倍量70%乙醇浸泡過(guò)夜，超聲提取1 h，重復(fù)三次，合并提取液，過(guò)濾，減壓濃縮干燥得浸膏30 g，為矮垂頭菊乙醇提取物(Ethanol extract ofCremanthodium humile，EECH)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)BABL/C 雄性小鼠，體重18～22 g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，許可證號(hào)SYXK(軍)2014-0029。

1.3 試劑

乙酰唑胺(100114)購(gòu)自武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購(gòu)自Sigma 公司;還原型輔酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗壞血酸(VC)、硫代巴比妥酸(TBA)、硝普鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺購(gòu)自阿拉丁試劑公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(100080-200707)、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(110831-200804)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。丙二?MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器

Spectramax i3 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);RE-3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SK3300L 超聲清洗器(上海精密儀器儀表有限公司);AE204 型電子天平(美梅特勒-托利多儀器有限公司);UV2800SPC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)LYDWC50-IIC 低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DPPH 清除實(shí)驗(yàn)

向125 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液中分別加入125 μL 0.1 mmol/L DPPH 70%乙醇溶液，室溫下暗處反應(yīng)30 min，以70%乙醇溶劑做空白對(duì)照，測(cè)量其在波長(zhǎng)517 nm 處的吸光度Ai。將125 μL 70%乙醇溶液分別與125 μL DPPH 70%乙醇溶液和125 μL 樣品溶液混合后，測(cè)定其在波長(zhǎng)517 nm 處的吸光度，分別計(jì)為A0和Aj。按式(1)計(jì)算其清除率，并計(jì)算其IC50。

2.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

向500 μL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液中依次加入50 μL 28 mmol/L 脫氧核糖(溶于pH=7.0 的0.2 mmol PBS)、50 μL EDTA(1 mmol/L)、50 μL 的FeCl2(1 mmol/L)和50 μL H2O2(1 mmol/L)，最后加入50 μL 抗壞血酸(1 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴孵育1 h 后依次加入250 μL 三氯乙酸(10%)和250 μL TBA(0.5%，溶于25 mmol/L 的NaOH 溶液)，沸水中孵育0.5 h，測(cè)定532 nm 處吸光度Ai，用500 μL 蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度A0，用PBS 代替脫氧核糖測(cè)得吸光度Aj。按式(1)計(jì)算其清除率，并計(jì)算其IC50。

2.3 超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)

向100 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液中依次加入50 μL NADH(500 μmol/L，溶解于0.2 mol/L pH=7.4 的PBS 中)、50 μL NBT(200 μmol/L)和50 μL PMS(20 μmol/L)。混合均勻后室溫下反應(yīng)8 min，測(cè)定其在560 nm 處的吸光度Ai。用100 μL 70%乙醇替代樣品，混合后測(cè)定其560 nm 處的吸光度A0;用50 μL 水取代PMS，混合后測(cè)定其在波長(zhǎng)560 nm 處的吸光度Aj。按式(1)計(jì)算其清除率，并計(jì)算其IC50。

2.4 一氧化氮清除實(shí)驗(yàn)

將100 μL 不同濃度的樣品溶液與100 μL 的硝普鈉(10 mmol/L，溶解在磷酸緩沖液中0.05 mol/L，pH 7.4)混合均勻后，室溫下孵育2.5 h，向混合溶液中加入900 μL 蒸餾水和0.5 mL 對(duì)氨基苯磺酸(33%，溶解在20% 的乙酸溶液中)，室溫放置5 min，最后加入0.5 mL 鹽酸萘乙二胺(0.1%，w/v)，室溫放置30 min 后，測(cè)定540 nm 處的吸光度Ai。用磷酸緩沖液代替硝普鈉時(shí)測(cè)得吸光度Aj，用70%乙醇代替樣品溶液時(shí)測(cè)得吸光度A0。按式(1)計(jì)算其清除率，并計(jì)算其IC50。

2.5 總黃酮含量測(cè)定

將50 μL NaNO2溶液(5%)加入到500 μL 的不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0～140 μg/mL)中，混合均勻。室溫下靜置6 min 后加入50 μL Al(NO3)3溶液(10%)，混勻后再靜置6 min，最后加入250 μL NaOH 溶液(4%)，再次混合均勻后靜置15 min，測(cè)定其在518 nm 處吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照相同方法求得樣品中總黃酮含量。

2.6 總多酚含量測(cè)定

將1 mL Folin-Ciocalteu 試劑分別與100 μL 的不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0～140 μg/mL)充分混合后，加入1 mL Na2CO3溶液(7%)，室溫放置5 h，測(cè)定其在760 nm 處吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照相同方法求得樣品中總酚含量。

2.7 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

將50 只清潔劑級(jí)雄性BABL/C 小鼠隨機(jī)分成5 組，缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、EECH低、中、高劑量組(125、250、500 mg/kg)，每組10只，連續(xù)灌胃給藥5 d，最后一次給藥60 min 后，將小鼠分別放入250 mL 廣口瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)含5 g 鈉石灰)，密封瓶口，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，待小鼠停止呼吸時(shí)記錄小鼠存活時(shí)間。利用存活時(shí)間和延長(zhǎng)率評(píng)價(jià)藥物的抗缺氧作用，確定EECH 最佳給藥劑量。延長(zhǎng)率=(藥物組存活時(shí)間-缺氧模型組存活時(shí)間)/缺氧模型組存活時(shí)間。

2.8 低壓低氧實(shí)驗(yàn)

將24 只SPF 級(jí)雄性BABL/C 小鼠隨機(jī)分成4組，正常組、缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、EECH 高劑量組500 mg/kg，每組6 只。給藥方式同2.7。最后一次給藥后，除正常組外，將其他3 組置于低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙中，以100 m/min 的速度減壓至模擬8000 m 海拔高度，并維持低壓低氧9 h，隨后快速升壓至正常氣壓。立即將小鼠脫臼處死，取大腦和心臟組織，用4 ℃生理鹽水制成10%的組織勻漿用于相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定。

2.9 指標(biāo)檢測(cè)

MDA 含量、SOD、CAT 和GSH-Px 活性測(cè)定按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 EECH 對(duì)DPPH 清除作用

結(jié)果如圖1 所示，EECH 對(duì)DPPH 自由基的清除作用存在較好的劑量依賴性。在濃度為120 mg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH 的清除率達(dá)到了79.92%，EECH和Vc 的IC50分別為80.90 ± 0.47 和30.39 ± 0.43 μg/mL。以上結(jié)果表明，EECH 對(duì)DPPH 自由基具有較好清除能力，但是其活性明顯弱于Vc。

圖2 EECH 對(duì)·OH 的清除率Fig.2 Hydroxyl scavenging effect of EECH

3.2 EECH 對(duì)羥自由基清除作用

從圖2 結(jié)果可以看出:隨著EECH 濃度的升高，其對(duì)·OH 的清除能力逐漸增強(qiáng)，具有明顯的劑量依賴性，經(jīng)計(jì)算其IC50為263.54 ± 6.82 μg/mL，顯著高于Vc(50.78 ± 2.45 μg/mL)。隨著濃度的增加，Vc 對(duì)·OH 的清除能力增加緩慢，而EECH 增長(zhǎng)迅速，但仍弱于Vc。

圖3 EECH 對(duì)的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging effect of EECH

3.3 EECH 對(duì)超氧陰離子清除作用

結(jié)果如圖3 所示，當(dāng)濃度低于200 μg/mL 時(shí)，隨著濃度的升高，EECH 和Vc 對(duì)的清除能力增加迅速，當(dāng)濃度大于200 μg/mL 時(shí)，二者的清除能力增長(zhǎng)速度明顯放緩，特別是Vc。總的來(lái)說(shuō)，EECH 對(duì)的清除能力要高于Vc。其IC50值為291.43 ± 2.45 μg/mL，顯著低于Vc 的IC50值(462.81 ± 3.24 μg/mL)。

3.4 EECH 的對(duì)NO 的清除能力

圖4 EECH 對(duì)NO 的清除率Fig.4 Nitric oxide radical scavenging effect

結(jié)果如圖4 所示，EECH 和Vc 對(duì)NO 清除作用與對(duì)的清除作用類似，隨著濃度的升高，清除能力逐漸增加，但是增長(zhǎng)的幅度越來(lái)越小。EECH的IC50(285.26 ± 4.45 μg/mL)明顯高于Vc(176.33 ± 5.76 μg/mL)，表明其對(duì)NO 的清除能力弱于Vc。

3.5 EECH 中總黃酮與總多酚含量

經(jīng)檢測(cè)，EECH 中總黃酮的含量高達(dá)378.35 ±7.04 mg 蘆丁/g 提取物，多酚含量為114.58 ±0.99 mg 沒(méi)食子酸/g 提取物。

3.6 EECH 對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響

從表1 結(jié)果可以看出:缺氧模型組小鼠在250 mL 廣口瓶?jī)?nèi)的存活時(shí)間為32.15 ±1.08 min，陽(yáng)性藥乙酰唑胺組可以顯著延長(zhǎng)存活時(shí)間至42.24 ±1.63 min(P＜0.01)，延長(zhǎng)率為31.38%。EECH 三組存在明顯則劑量依賴性，低劑量組的存活時(shí)間略長(zhǎng)于模型組，但是低于乙酰唑胺組，中劑量組的存活時(shí)間為44.12 ±3.25 min，效果與乙酰唑胺相當(dāng)，而高劑量組的存活時(shí)間達(dá)到47.37 ±2.56 min，延長(zhǎng)率為47.34%，顯著高于缺氧模型組(P＜0.01)和乙酰唑胺組(P＜0.05)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用高劑量進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

表1 EECH 對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

表1 EECH 對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

注:與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與乙酰唑胺組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note:Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with Acetazolamide group，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

3.7 EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織中MDA 含量的影響

結(jié)果如圖5 所示，對(duì)所有組別而言，腦組織中MDA 含量顯著低于心肌組織。與正常組比較，缺氧模型組小鼠心、腦組織MDA 含量顯著升高(P＜0.01)，經(jīng)乙酰唑胺和EECH 預(yù)處理后，缺氧小鼠心、腦組織中MDA 含量顯著降低(P＜0.01 或P＜0.05)。

圖5 EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織中MDA 含量的影響(n=6，±s)Fig.5 Effects of EECH on the MDA content in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

3.8 EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT和GSH-Px 活性的影響

結(jié)果如表2 所示，與正常組比較，缺氧模型組小鼠心、腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，經(jīng)乙酰唑胺和EECH 預(yù)處理后，小鼠心、腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活力均顯著升高。但是EECH 的效果顯著優(yōu)于乙酰唑胺。

4 討論

表2 EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影響(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

表2 EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影響(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

注:與正常組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with normal group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

矮垂頭菊常年生長(zhǎng)在低壓低氧的環(huán)境中，為了抵抗氧化應(yīng)激，其體內(nèi)可能含有具有優(yōu)異抗氧化活性的物質(zhì)。為了證明上述猜想，本研究首先考察了EECH 對(duì)和NO 的清除作用。DPPH 是一種穩(wěn)定的含氮自由基，其乙醇溶液呈深紫色，自由基清除劑會(huì)使其顏色變淺。該法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于樣品，特別是植物提取物樣品的抗氧化活性測(cè)定［7］。·OH 被認(rèn)為是ROS 中活性最強(qiáng)的自由基，它能夠無(wú)選擇性的攻擊幾乎所有生物大分子，造成細(xì)胞損傷。研究表明:心血管疾病、腫瘤、糖尿病以及阿爾茲海默病的發(fā)生均與·OH 有關(guān)［8］。自身活性較弱，但是其能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的H2O2和·OH［9］。NO 是體內(nèi)重要的功能分子，發(fā)揮著血壓調(diào)節(jié)、神經(jīng)信號(hào)傳遞、控制血管舒張和松弛平滑肌等眾多生理功能。但是NO 還會(huì)與反應(yīng)生成氧化性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝酸根離子(ONOO-)，從而導(dǎo)致組織器官氧化損傷［10］。從文中結(jié)果可以看出:矮垂頭菊乙醇提取物對(duì)DPPH、·OH 和NO 的清除能力弱于Vc，但其對(duì)的清除能力明顯優(yōu)于Vc?？偟膩?lái)說(shuō)，EECH 對(duì)四種自由基均表現(xiàn)出一定的清除活性，盡管活性弱于Vc，但仍是一種非常有前景的天然抗氧化劑。

黃酮和多酚是植物體內(nèi)含有的非常重要的次生代謝產(chǎn)物，也是許多植物提取物抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［11］。通過(guò)對(duì)EECH 的總黃酮和總多酚的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明:其高濃度的總黃酮可能其發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

盡管低壓低氧對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷的作用機(jī)制尚不完全明確，但是自由基代謝紊亂是損傷產(chǎn)生的重要原因之一。有研究指出:通過(guò)攝取抗氧化劑，例如維生素E 和乙酰左旋肉堿等能夠減輕低壓低氧造成的損傷［12，13］。為此，本研究首先利用小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)考察了自由基清除劑EECH 的抗缺氧能力。結(jié)果表明:灌胃給藥高、中、低劑量的EECH 均能不同程度地延長(zhǎng)缺氧小鼠的存活時(shí)間，且呈劑量依賴性，其中，EECH 最高劑量組表現(xiàn)出顯著優(yōu)于乙酰唑胺的抗缺氧效果。

大腦和心臟是機(jī)體中氧代謝最為活躍的器官，這也造成它們對(duì)低壓低氧非常敏感［14，15］。為了闡明EECH 對(duì)低壓低氧小鼠心腦組織的保護(hù)作用，本研究對(duì)心腦組織中自由基代謝相關(guān)生化指標(biāo)進(jìn)行了考察。

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度［16］。低壓低氧會(huì)導(dǎo)致小鼠心腦組織中MDA 含量顯著升高，經(jīng)EECH 預(yù)處理后，小鼠心腦組織中MDA 含量降低明顯，說(shuō)明EECH 對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化有抑制作用。

SOD、CAT 和GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，被認(rèn)為是抵抗氧化應(yīng)激損傷的第一道防線。SOD 可以通過(guò)歧化反應(yīng)將·OH 轉(zhuǎn)化為H2O2。生成的H2O2又可以進(jìn)一步被CAT 和GSH-Px 清除，三者協(xié)同維持機(jī)體內(nèi)自由基代謝的穩(wěn)態(tài)［17］。低壓低氧會(huì)導(dǎo)致小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px的活性顯著降低，抗氧化系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致自由基代謝紊亂和ROS 大量蓄積。EECH 能夠提高低壓低氧條件下小鼠心腦組織中抗氧化酶的活性，維持機(jī)體內(nèi)自由基代謝穩(wěn)態(tài)，減少低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，矮垂頭菊乙醇提取物表現(xiàn)出優(yōu)異的體外自由基清除活性，是一種高效的天然抗氧化劑，其含有的高濃度總黃酮，可以作為獲得黃酮類化合物的天然來(lái)源。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明:矮垂頭菊乙醇提取物能夠顯著延長(zhǎng)缺氧小鼠的存活時(shí)間，緩解低壓低氧對(duì)小鼠心腦組織的損傷，其機(jī)制可能與維持機(jī)體抗氧化酶的活性、調(diào)節(jié)自由基代謝有關(guān)。

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