菘藍葉和根多糖的提取工藝

張穎

摘要：試驗采用水提醇沉法，以菘藍（Isatis minima Bunge）葉和根粉末為原料，以料液比（m/V，g∶mL）、提取溫度、提取時間為考察因素，通過單因素試驗比較得出，菘藍根、葉中多糖的最佳提取條件為料液比1∶25，在80～95 ℃條件下提取2～3 h，其中根中的得率要高于葉中。通過正交試驗進一步研究得出影響菘藍根多糖提取的因素依次為料液比、提取溫度、提取時間，即料液比為1∶25，提取時間3.5 h，提取溫度95℃，在此條件下菘藍根多糖得率為3.93%。

關鍵詞： 菘藍（Isatis minima Bunge）;多糖;正交試驗;提取工藝

中圖分類號：TS201.2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2886-03

Extraction of Polysaccharide from the Leaves and Roots of Isatis Tinctoria

ZHANG Ying1，2

（1. Panzhihua University， College of Biological and Chemistry Engineering， Panzhihua 617000， Sichuan， China;2. Key Laboratory of Dry-hot Valley Characteristic Bio-Resources Development at university of Sichuan Province， Panzhihua 617000， Sichuan， China）

Abstract： The effects of liquid ratio， temperature and time on polysaccharide extraction were investigated through orthogonal design after three single factor experiments. The test showed that the optimal liquid ratio was 1∶25， extracted for 2～3 h under the temperature of 80～95℃. Through comparative studies， the extraction of polysaccharide from isatis tinctoria root was better.The optimum extraction conditions were as follows： liquid ratio 1∶25，extracting time 3.5 h， temperature 95 ℃， and the polysaccharide content could reach 3.93%.

Key words： isatis tinctoria （Isatis minima Bunge）; polysaccharide; orthogonal design; extraction

大青葉和板藍根系常用中藥，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，分別為十字花科植物菘藍（Isatis minima Bunge）的葉和根。板藍根利咽功效較好，而大青葉涼血化斑之功效較好。有關大青葉和板藍根有效成分的研究多集中在靛藍、有機酸等[1，2]幾個方面。多糖作為大青葉和板藍根的有效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用。由于多糖從作用機理到臨床研究等方面的應用增多，多糖的提取分離及鑒定技術具有較大的應用價值，能為大青葉和板藍根多糖的功能食品與新藥開發(fā)及大青葉的質(zhì)量控制打下技術基礎[3-5]。多糖的提取分離方式主要有水煎煮法、酸堿提取法、酶法、超臨界流體法和超聲波法，含量測定主要采用雙波長薄層掃描法、紫外分光光度法和高效液相色譜測定法等[6-11]。綜合經(jīng)濟原則，本研究嘗試采用水提醇沉法，利用單因素試驗和正交試驗比較菘藍葉和根多糖提取的工藝條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菘藍植株購于攀枝花市仁和區(qū)種植基地，分別取葉和根洗凈，60 ℃烘干，粉碎后過60目篩，得干粉備用。

1.2 ?試劑

石油醚、無水乙醇、無水葡萄糖、乙醚、濃硫酸購于成都市科龍化工試劑廠，苯酚購于天津市化學試劑廠六廠，以上試劑均為分析純。

1.3 ?儀器

722型紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）;60M AQM-100型純水儀（北京中西遠大科技有限公司）;CP324S型分析天平（金紫光科技發(fā)展有限公司）;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州杜甫儀器廠）;02-2AB型電熱恒溫干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.4 ?方法

1.4.1 ?葡萄糖標準液的配制 ?準確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，用去離子水溶解并準確定容至100 mL，再稀釋10倍，即得100 μg/mL的葡萄糖標準液。用吸量管準確移取苯酚5 mL，去離子水稀釋定容至100 mL，即得5 %苯酚液，棕色瓶中避光保存。

分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標準溶液定容至2.0 mL，加入5 %苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL混勻，置于沸水浴中保溫8 min，冷卻于室溫后靜置15 min。以空白試液為對照，在最大吸收波長485 nm處測定吸光度，每組測定3次。以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，并求回歸方程。endprint

1.4.2 ?多糖提取工藝 ?提取工藝流程為：原料→粉碎→脫脂→熱水浸提→取上清液→二次提取→合并上清液→醇沉→有機溶劑醇洗滌→干燥→粗多糖成品。

準確稱取備用葉或根樣品10 g，置于索氏回流器中，經(jīng)一定量的乙醚回流抽提脫脂2次，每次2 h。取藥渣，置于帶塞錐形瓶中，按照設定的料液比加去離子水，設定并保持溫度恒定，在水浴鍋中進行攪拌提取。將提取液冷卻至室溫，抽濾，將濾渣進行二次提?。ㄅc第一次提取條件相同），合并濾液，減壓濃縮，加人95 %乙醇至含醇量80 %[11]，靜置24 h后抽濾得沉淀，用無水乙醇和乙醚反復洗滌沉淀數(shù)次，60 ℃恒溫干燥，得到粗多糖。

1.4.3 ?單因素試驗 ?分別稱取葉和根10 g，分別在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為1、2、3、4、5 h，料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（m/V，g∶mL，下同）條件下提取2次，每組重復3次，得出最佳提取條件。

1.4.4 ?正交試驗 ?在單因素試驗的基礎上，選擇料液比、提取溫度和提取時間作3因素3水平的正交試驗，每組3次重復，以菘藍根多糖得率為考察指標，對多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，因素與水平見表1。

1.4.5 ?多糖含量測定 ?取干燥至恒重的粗多糖樣品100 mg，定容至100 mL再稀釋10倍，吸取樣品溶液2 mL于10 mL試管中，以制作標準曲線的方法操作。測定其吸光度并帶入回歸方程計算葉和根中多糖在原料中的得率。多糖得率計算公式如下：

多糖得率=■×100%

式中，Vs=100 mL;n為稀釋倍數(shù);C為樣品溶液中多糖濃度（μg/mL）;W0為稱取樣品質(zhì)量（g）;M粗=提取粗多糖質(zhì)量（g）;M料為大青葉原料質(zhì)量（g）。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線繪制

取吸光度對葡萄糖液濃度進行線性回歸，得回歸方程及標準曲線（圖1）。

2.2 ?單因素試驗結果

2.2.1 ?料液比對多糖得率的影響 ?由圖2可知，隨著料液比的降低，多糖得率呈上升趨勢，當料液比達到1∶25左右，多糖得率較高，再繼續(xù)增加溶劑量，多糖得率變化不大。如果去離子水用量過多，不利于以后的濃縮分離，而且增加醇沉中的醇用量，故選擇1∶25為適合的料液條件，以根為原料的多糖得率稍高于葉。

2.2.2 ?提取溫度對多糖得率的影響 ?提取溫度從60 ℃升高到80 ℃時，多糖的得率迅速增加，超過80 ℃多糖的得率變化平緩，而溫度達到95 ℃之后多糖的得率變化甚至有降低的趨勢（圖3）。其原因可能是溫度過低，溶劑的滲透能力和溶解能力差，多糖不能有效溶出;溫度過高雖對細胞的破壞作用增大，有利于多糖的浸出，但是會導致多糖裂解，使得多糖得率降低。故提取溫度選擇80～95 ℃時效果較好，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.2.3 ?提取時間對多糖得率的影響 ?隨著提取時間的延長，多糖的得率逐漸增加（圖4），提取3 h后多糖得率增加緩慢?？紤]到時間過長會導致多糖結構破壞和降解，故提取時間選擇2～3 h，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.3 ?正交試驗

正交試驗結果見表2，由表2可知，各因素對菘藍根多糖得率影響大小依次為料液比、提取溫度、提取時間。確定最佳提取工藝條件為A2B3C3，即在料液比1∶25時提取2次，每次3.5 h，提取溫度95 ℃。在此最佳組合工藝條件下驗證，多糖得率為3.93%。

3 ?小結與討論

本試驗以菘藍葉和根為原料，通過單因素試驗得出菘藍根、葉中多糖的最佳提取條件為料液比1∶25，在80～95 ℃條件下提取2～3 h，根中多糖得率高于葉中，通過正交試驗得在料液比1∶25，95 ℃下提取3.5 h時菘藍根中多糖得率為3.93%。

多糖可溶于水，在多糖的水溶液中加入乙醇會破壞多糖與水形成的氫鍵，降低多糖溶解度，使多糖以沉淀形式析出。利用多糖的這一性質(zhì)，可將多糖從水溶液中沉淀出來。相比酶提法、超聲法和超臨界萃取法等，傳統(tǒng)的水提醇沉法有利于節(jié)約提取成本和某些負效應，如酶法降解副產(chǎn)物對提取會有影響，超聲波的凝聚作用以及熱點作用下多糖的降解問題等[4，5]。本試驗中菘藍根多糖得率高于葉多糖得率[12-15]，與其他研究結果一致。影響多糖得率的因素復雜，包括料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、醇沉濃度、醇沉時間等，本研究僅取前三個常見因素作正交優(yōu)選。今后有必要就工藝純化方面和提取工藝中的其他因素的影響效果做深入研究。

參考文獻：

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[12] 高續(xù)春.多糖提取純化方法研究進展[J].榆林學院學報，2009，19（4）：65-67.

[13] 張體祥，劉 ?捷，張 ?萍，等.板藍根多糖的提取和純化工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009， 20（8）：1992-1994.

[14] 陳 ?奎，陳易彬. 板藍根多糖提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（4）：57-59.

[15] 張 ?萍，劉 ?捷，鄧揚悟，等.板藍根多糖的提取工藝及其清除自由基作用的初步研究[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2006，27（3）：36-38.endprint

1.4.2 ?多糖提取工藝 ?提取工藝流程為：原料→粉碎→脫脂→熱水浸提→取上清液→二次提取→合并上清液→醇沉→有機溶劑醇洗滌→干燥→粗多糖成品。

準確稱取備用葉或根樣品10 g，置于索氏回流器中，經(jīng)一定量的乙醚回流抽提脫脂2次，每次2 h。取藥渣，置于帶塞錐形瓶中，按照設定的料液比加去離子水，設定并保持溫度恒定，在水浴鍋中進行攪拌提取。將提取液冷卻至室溫，抽濾，將濾渣進行二次提?。ㄅc第一次提取條件相同），合并濾液，減壓濃縮，加人95 %乙醇至含醇量80 %[11]，靜置24 h后抽濾得沉淀，用無水乙醇和乙醚反復洗滌沉淀數(shù)次，60 ℃恒溫干燥，得到粗多糖。

1.4.3 ?單因素試驗 ?分別稱取葉和根10 g，分別在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為1、2、3、4、5 h，料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（m/V，g∶mL，下同）條件下提取2次，每組重復3次，得出最佳提取條件。

1.4.4 ?正交試驗 ?在單因素試驗的基礎上，選擇料液比、提取溫度和提取時間作3因素3水平的正交試驗，每組3次重復，以菘藍根多糖得率為考察指標，對多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，因素與水平見表1。

1.4.5 ?多糖含量測定 ?取干燥至恒重的粗多糖樣品100 mg，定容至100 mL再稀釋10倍，吸取樣品溶液2 mL于10 mL試管中，以制作標準曲線的方法操作。測定其吸光度并帶入回歸方程計算葉和根中多糖在原料中的得率。多糖得率計算公式如下：

多糖得率=■×100%

式中，Vs=100 mL;n為稀釋倍數(shù);C為樣品溶液中多糖濃度（μg/mL）;W0為稱取樣品質(zhì)量（g）;M粗=提取粗多糖質(zhì)量（g）;M料為大青葉原料質(zhì)量（g）。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線繪制

取吸光度對葡萄糖液濃度進行線性回歸，得回歸方程及標準曲線（圖1）。

2.2 ?單因素試驗結果

2.2.1 ?料液比對多糖得率的影響 ?由圖2可知，隨著料液比的降低，多糖得率呈上升趨勢，當料液比達到1∶25左右，多糖得率較高，再繼續(xù)增加溶劑量，多糖得率變化不大。如果去離子水用量過多，不利于以后的濃縮分離，而且增加醇沉中的醇用量，故選擇1∶25為適合的料液條件，以根為原料的多糖得率稍高于葉。

2.2.2 ?提取溫度對多糖得率的影響 ?提取溫度從60 ℃升高到80 ℃時，多糖的得率迅速增加，超過80 ℃多糖的得率變化平緩，而溫度達到95 ℃之后多糖的得率變化甚至有降低的趨勢（圖3）。其原因可能是溫度過低，溶劑的滲透能力和溶解能力差，多糖不能有效溶出;溫度過高雖對細胞的破壞作用增大，有利于多糖的浸出，但是會導致多糖裂解，使得多糖得率降低。故提取溫度選擇80～95 ℃時效果較好，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.2.3 ?提取時間對多糖得率的影響 ?隨著提取時間的延長，多糖的得率逐漸增加（圖4），提取3 h后多糖得率增加緩慢。考慮到時間過長會導致多糖結構破壞和降解，故提取時間選擇2～3 h，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.3 ?正交試驗

正交試驗結果見表2，由表2可知，各因素對菘藍根多糖得率影響大小依次為料液比、提取溫度、提取時間。確定最佳提取工藝條件為A2B3C3，即在料液比1∶25時提取2次，每次3.5 h，提取溫度95 ℃。在此最佳組合工藝條件下驗證，多糖得率為3.93%。

3 ?小結與討論

本試驗以菘藍葉和根為原料，通過單因素試驗得出菘藍根、葉中多糖的最佳提取條件為料液比1∶25，在80～95 ℃條件下提取2～3 h，根中多糖得率高于葉中，通過正交試驗得在料液比1∶25，95 ℃下提取3.5 h時菘藍根中多糖得率為3.93%。

多糖可溶于水，在多糖的水溶液中加入乙醇會破壞多糖與水形成的氫鍵，降低多糖溶解度，使多糖以沉淀形式析出。利用多糖的這一性質(zhì)，可將多糖從水溶液中沉淀出來。相比酶提法、超聲法和超臨界萃取法等，傳統(tǒng)的水提醇沉法有利于節(jié)約提取成本和某些負效應，如酶法降解副產(chǎn)物對提取會有影響，超聲波的凝聚作用以及熱點作用下多糖的降解問題等[4，5]。本試驗中菘藍根多糖得率高于葉多糖得率[12-15]，與其他研究結果一致。影響多糖得率的因素復雜，包括料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、醇沉濃度、醇沉時間等，本研究僅取前三個常見因素作正交優(yōu)選。今后有必要就工藝純化方面和提取工藝中的其他因素的影響效果做深入研究。

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[14] 陳 ?奎，陳易彬. 板藍根多糖提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（4）：57-59.

[15] 張 ?萍，劉 ?捷，鄧揚悟，等.板藍根多糖的提取工藝及其清除自由基作用的初步研究[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2006，27（3）：36-38.endprint

1.4.2 ?多糖提取工藝 ?提取工藝流程為：原料→粉碎→脫脂→熱水浸提→取上清液→二次提取→合并上清液→醇沉→有機溶劑醇洗滌→干燥→粗多糖成品。

準確稱取備用葉或根樣品10 g，置于索氏回流器中，經(jīng)一定量的乙醚回流抽提脫脂2次，每次2 h。取藥渣，置于帶塞錐形瓶中，按照設定的料液比加去離子水，設定并保持溫度恒定，在水浴鍋中進行攪拌提取。將提取液冷卻至室溫，抽濾，將濾渣進行二次提?。ㄅc第一次提取條件相同），合并濾液，減壓濃縮，加人95 %乙醇至含醇量80 %[11]，靜置24 h后抽濾得沉淀，用無水乙醇和乙醚反復洗滌沉淀數(shù)次，60 ℃恒溫干燥，得到粗多糖。

1.4.3 ?單因素試驗 ?分別稱取葉和根10 g，分別在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時間為1、2、3、4、5 h，料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（m/V，g∶mL，下同）條件下提取2次，每組重復3次，得出最佳提取條件。

1.4.4 ?正交試驗 ?在單因素試驗的基礎上，選擇料液比、提取溫度和提取時間作3因素3水平的正交試驗，每組3次重復，以菘藍根多糖得率為考察指標，對多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，因素與水平見表1。

1.4.5 ?多糖含量測定 ?取干燥至恒重的粗多糖樣品100 mg，定容至100 mL再稀釋10倍，吸取樣品溶液2 mL于10 mL試管中，以制作標準曲線的方法操作。測定其吸光度并帶入回歸方程計算葉和根中多糖在原料中的得率。多糖得率計算公式如下：

多糖得率=■×100%

式中，Vs=100 mL;n為稀釋倍數(shù);C為樣品溶液中多糖濃度（μg/mL）;W0為稱取樣品質(zhì)量（g）;M粗=提取粗多糖質(zhì)量（g）;M料為大青葉原料質(zhì)量（g）。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線繪制

取吸光度對葡萄糖液濃度進行線性回歸，得回歸方程及標準曲線（圖1）。

2.2 ?單因素試驗結果

2.2.1 ?料液比對多糖得率的影響 ?由圖2可知，隨著料液比的降低，多糖得率呈上升趨勢，當料液比達到1∶25左右，多糖得率較高，再繼續(xù)增加溶劑量，多糖得率變化不大。如果去離子水用量過多，不利于以后的濃縮分離，而且增加醇沉中的醇用量，故選擇1∶25為適合的料液條件，以根為原料的多糖得率稍高于葉。

2.2.2 ?提取溫度對多糖得率的影響 ?提取溫度從60 ℃升高到80 ℃時，多糖的得率迅速增加，超過80 ℃多糖的得率變化平緩，而溫度達到95 ℃之后多糖的得率變化甚至有降低的趨勢（圖3）。其原因可能是溫度過低，溶劑的滲透能力和溶解能力差，多糖不能有效溶出;溫度過高雖對細胞的破壞作用增大，有利于多糖的浸出，但是會導致多糖裂解，使得多糖得率降低。故提取溫度選擇80～95 ℃時效果較好，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.2.3 ?提取時間對多糖得率的影響 ?隨著提取時間的延長，多糖的得率逐漸增加（圖4），提取3 h后多糖得率增加緩慢?？紤]到時間過長會導致多糖結構破壞和降解，故提取時間選擇2～3 h，以根為原料的提取結果稍高于葉。

2.3 ?正交試驗

正交試驗結果見表2，由表2可知，各因素對菘藍根多糖得率影響大小依次為料液比、提取溫度、提取時間。確定最佳提取工藝條件為A2B3C3，即在料液比1∶25時提取2次，每次3.5 h，提取溫度95 ℃。在此最佳組合工藝條件下驗證，多糖得率為3.93%。

3 ?小結與討論

本試驗以菘藍葉和根為原料，通過單因素試驗得出菘藍根、葉中多糖的最佳提取條件為料液比1∶25，在80～95 ℃條件下提取2～3 h，根中多糖得率高于葉中，通過正交試驗得在料液比1∶25，95 ℃下提取3.5 h時菘藍根中多糖得率為3.93%。

多糖可溶于水，在多糖的水溶液中加入乙醇會破壞多糖與水形成的氫鍵，降低多糖溶解度，使多糖以沉淀形式析出。利用多糖的這一性質(zhì)，可將多糖從水溶液中沉淀出來。相比酶提法、超聲法和超臨界萃取法等，傳統(tǒng)的水提醇沉法有利于節(jié)約提取成本和某些負效應，如酶法降解副產(chǎn)物對提取會有影響，超聲波的凝聚作用以及熱點作用下多糖的降解問題等[4，5]。本試驗中菘藍根多糖得率高于葉多糖得率[12-15]，與其他研究結果一致。影響多糖得率的因素復雜，包括料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、醇沉濃度、醇沉時間等，本研究僅取前三個常見因素作正交優(yōu)選。今后有必要就工藝純化方面和提取工藝中的其他因素的影響效果做深入研究。

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