攜帶小鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定*

楊華安，張 揚(yáng)，楊鈺興， 胡 溯，茍 欣

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科 401120 ；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科 400016)

·技術(shù)與方法·

攜帶小鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定*

楊華安1，張 揚(yáng)1，楊鈺興1， 胡 溯1，茍 欣2△

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科 401120 ；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科 400016)

目的構(gòu)建攜帶小鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)的重組慢病毒載體，并檢測(cè)STAT3的蛋白表達(dá)，進(jìn)行慢病毒包裝并鑒定。方法將小鼠成肌細(xì)胞總RNA通過STAT3引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA PCR擴(kuò)增、回收后，同pLVX -IRES-ZsGreen1載體片段連接，酶切鑒定及測(cè)序，將pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞,Western blot檢測(cè)STAT3表達(dá)量，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法包裝出病毒上清。結(jié)果測(cè)序結(jié)果證實(shí)STAT3成功插入pLVX -IRES-ZsGreen1慢病毒載體，成功構(gòu)建了慢病毒載體pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3,共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞48 h,Western blot檢測(cè)STAT3表達(dá)量明顯增強(qiáng)。測(cè)定病毒滴度為8.4×107TU/mL。結(jié)論成功構(gòu)建了STAT3基因的重組慢病毒表達(dá)載體,為進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3；慢病毒載體

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)因子，具有促進(jìn)增殖、抑制凋亡，特別是促進(jìn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成等多種作用[1]，提示其在樹突狀細(xì)胞致免疫耐受的形成中起相關(guān)作用。本研究擬攜帶小鼠STAT3重組慢病毒載體，觀察其蛋白表達(dá)情況，進(jìn)行慢病毒包裝，測(cè)定病毒滴度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRIzol(ambion)；DNA凝膠回收試劑盒(東盛生物)；M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)；T4 DNA Ligase(Invitrogen)、2×PFU PCR MasterMix(Tiangen)；XhoⅠ、BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs)；pLVX-IRES-ZsGreen1載體及病毒包裝及檢測(cè)系統(tǒng)(Clontech)；引物均由Invitrogen公司合成。DMEM培養(yǎng)基(Gibco);FBS(Gibco,原產(chǎn)地澳洲)；0.25%胰酶(1x，Gibco)；DNA Transfection reagent(轉(zhuǎn)染試劑，Roche)；Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco)。anti-STAT3抗體(Abcam)； anti-GAPDH 抗體(CST)、anti-Rabbit二抗(CST)；Super ECL檢測(cè)試劑盒(KeyGEN)。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3構(gòu)建 收集培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞，抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Stat3 上游引物:5′-CCG CTC GAG ATG GCT CAG TGG AAC CAG CT-3′，下游引物:5′-CGC GGA TCC TCA CAT GGG GGA GGT AGC A-3′，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min×30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。電泳切膠回收DNA片段，XhoⅠ和BamH Ⅰ雙酶切同pLVX -IRES-ZsGreen1載體片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α于37 ℃培養(yǎng)16 h。取單菌落菌液PCR鑒定，并擴(kuò)增菌液，小量快速抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定、電泳，并測(cè)序分析。

1.2.2 轉(zhuǎn)染重組載體pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3后293 T細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá) 設(shè)置空載體對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,提取蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳。用GAPDH作內(nèi)參，抗體滴度參照抗體說明書。 ECL化學(xué)發(fā)光顯影。STAT3蛋白表達(dá)強(qiáng)度的計(jì)算:表達(dá)強(qiáng)度=STAT3條帶灰度/GAPDH條帶灰度。

1.2.3 慢病毒載體的包裝 共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞及分組接種293 T細(xì)胞，每個(gè)T 75細(xì)胞培養(yǎng)瓶9×106～10×106個(gè)細(xì)胞，次日觀察細(xì)胞密度，達(dá)80%～90% 即可用pLVX-IRES-ZsGreenl-STAT3重組慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。該慢病毒載體的3種質(zhì)粒成分psPAX2、pMD2G和Plvx-IRES-ZsGreenl 20 μg，濃度比例為1∶1∶2。轉(zhuǎn)染24 h和48 h后收集病毒上清以0.45 μm濾器過濾，于40 mL超速離心管中，4 ℃、72 000×g離心120 min；500 μL PBS重懸病毒沉淀，置于4 ℃冰箱保存。同時(shí)將空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293 T細(xì)胞，并收集上清。

1.2.4 滴度測(cè)定 滴度檢測(cè)前1 d，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293 T細(xì)胞鋪96孔板，每個(gè)孔加入總體積100 μL 約 5×103個(gè)細(xì)胞； 第2天，準(zhǔn)備好無菌 EP 管，取待測(cè)定的病毒原液 10 μL 加入到第1個(gè)管中，輕輕混勻后，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基倍比稀釋病毒液； 選取所需的細(xì)胞孔，每孔加入10 μL 稀釋好的病毒液，放入 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；36～48 h后，每孔加入 100 μL 新鮮培養(yǎng)液，小心操作，不要吹起細(xì)胞； 3 d后，觀察293 T細(xì)胞熒光表達(dá)情況，并計(jì)數(shù)帶熒光的細(xì)胞將得到的數(shù)值除以稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出病毒原液的滴度值。病毒滴度(BT=TU/mL)計(jì)算公式： TU/μL=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×V×稀釋倍數(shù)；V=每孔加入病毒稀釋液體積(μL)，TU/mL=TU/μL×1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間比較使用t檢驗(yàn),組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 STAT3基因的鑒定 根據(jù)GenBank的STAT3基因編碼區(qū)(CDS)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，可見2 370 bp的特異條帶，與理論值一致。見圖1。

M：標(biāo)記物；1～3：條帶。

圖1 STAT3 PCR 酶切鑒定圖

2.2 質(zhì)粒測(cè)序 進(jìn)一步質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，目的片段插入方向正確，所測(cè)序列與GenBank中STAT3基因序列比較無差異。部分測(cè)序結(jié)果見圖2。

2.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后293 T細(xì)胞中STAT3的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,與轉(zhuǎn)染空載體重組質(zhì)粒的293 T細(xì)胞相比,pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293 T細(xì)胞,STAT3的總蛋白水平顯著增加。見圖3。

2.4 熒光顯微鏡觀察結(jié)果 3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞觀察及病毒滴度測(cè)定轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡觀察可見大量綠色熒光(圖4)，提示轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)計(jì)算，病毒滴度為8.4×107TU/mL。

圖2 STAT3 mRNA部分測(cè)序圖

NC:空載體對(duì)照組；STAT1及STAT2：pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3重組質(zhì)粒組。

圖3 Western blot檢測(cè)

圖4 293 T細(xì)胞熒光圖微觀察結(jié)果

3 討 論

樹突狀細(xì)胞是高特異性的抗原呈遞細(xì)胞，它收集各種輸入信號(hào)，介導(dǎo)免疫反應(yīng)；同時(shí)在自身免疫性疾病或移植耐受研究中起重要作用。目前研究表明樹突狀細(xì)胞的激活對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)起決定性作用，在無感染和相關(guān)“危險(xiǎn)”信號(hào)刺激下,未成熟樹突狀細(xì)胞低水平、穩(wěn)態(tài)地進(jìn)入淋巴組織，這些靜態(tài)樹突狀細(xì)胞幫助維持外周免疫耐受[2]。腫瘤“逃逸”的機(jī)制之一是使免疫系統(tǒng)的未成熟樹突狀細(xì)胞數(shù)量增加，這類未成熟樹突狀細(xì)胞在患者體內(nèi)不能轉(zhuǎn)分化為成熟狀態(tài)，而誘導(dǎo)耐受[3-4]。

正常細(xì)胞中STAT3在增殖、分化、凋亡等生理過程中起重要作用，正常細(xì)胞中STAT3磷酸化過程很短暫，而在許多腫瘤組織以及細(xì)胞系中可以見到STAT3分子持續(xù)活化[5]，有利于免疫抑制微環(huán)境形成，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的免疫耐受[6],而通過RNA干擾細(xì)胞的STAT3表達(dá)，能明顯增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的免疫活性[7]。最近研究人員發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病同STAT3基因突變相關(guān)[8]。而Hp細(xì)胞毒素相關(guān)基因能通過IL-10激活STAT3信號(hào)通路抑制樹突狀細(xì)胞的成熟及功能[9]。因此，STAT3可能同樹突狀細(xì)胞的分化密切相關(guān)[10]。

通過慢病毒載體，將STAT3基因(目的基因)和GFP基因(報(bào)告基因)通過IRES(核糖體內(nèi)部進(jìn)入序列)連接并轉(zhuǎn)入到慢病毒主體質(zhì)粒中，載體中的IRES可以使STAT3和GFP分別在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。將重組載體轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞驗(yàn)證了STAT3插入載體后，Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的293 T細(xì)胞STAT3表達(dá)明顯強(qiáng)化，表明其蛋白表達(dá)的正確及有效表達(dá)。載體質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞48 h后通過熒光顯微鏡觀察到大量綠色熒光，說明包裝產(chǎn)毒成功。病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示，獲得的病毒滴度達(dá)到8.4×107TU/mL。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了STAT3和GFP基因共表達(dá)的高滴度慢病毒載體，為后繼實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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Construction and identification of a recombinant lentivirus harboring expressing Mus musculus STAT3 gene*

YangHuaan1，ZhangYang1，YangYuxin1，Husuo1，GouXin2△

(1.DepartmentofUrologicalSurgery,YubeiDistrictPeople′sHospital,Chongqing401120，China; 2.DepartmentofUrologicalSurgery，F(xiàn)irstAffiliatedHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

ObjectiveTo construct recombinant lentivirus with the gene STAT3 of the Mus musculus,measure the expression of STAT3，and conduct lentivirus packing and identification.MethodsThe mRNA of mouse myoblast was extracted and transformed into STAT3 cDNA by the special primer.then,STAT3 cDNA was amplified and reclaimed and inseted into pLVX -IRES-ZsGreen1 vector.Cleavage map and sequencing analysis were used for identification of the recombinant lentivirus vector(pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3).293 T cells were transfected with main vector pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3.and 48 h later,Western blott detected the expression of STAT3 protein.Lentiviral vectors were packaged and the titer was determined.ResultsThe lentiviral vector plasmid pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3 was identified correctly by cleavage map and Co-transfection of 293 T cells with 48 h,the expression of STAT3 was significantly enhanced by western blot.And DNA sequencing analysis confirmed that STAT3 gene sequencing was exactly the same with that reported by genbank．Conclusion Lentiviral vector carrying STAT3 was successfnlly constructed and could express STAT3 with high efficiency,and can be used in further study.

signal transducers and activators of transcription 3;lentivirus vector

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.018

重慶市科委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012JJA10002)；重慶市衛(wèi)生局基金資助項(xiàng)目(20122296)。

：楊華安(1981-)，碩士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟I移植及膀胱腫瘤?！?/p>

，E-mail：cymnk@163．com。

R392.4

A

1671-8348(2015)27-3803-02

2015-04-15

2015-06-20)