ERK1/2參與IL—33誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化過(guò)程

黃曉燕+楊曦+廉姜芳

[摘要] 目的 探討ERK1/2通路在IL-33激活心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其作用。 方法 培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞，10 ng/mL IL-33刺激細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)MTT法檢測(cè)IL-33對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志性基因α-SMA 及通路關(guān)鍵分子TRAF-6的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)α-SMA 、TRAF-6及p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 IL-33能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖（P<0.05）；IL-33刺激細(xì)胞24h，TRAF-6表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），p-ERK1/2 蛋白水平表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；IL-33干預(yù)24h后α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），ERK1/2特異性阻斷劑PD98059可有效抑制該效應(yīng)。 結(jié)論 ERK1/2通路參與了IL-33誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] IL-33/ST2信號(hào)通路；ERK1/2；心臟成纖維細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）34-0004-04

心肌纖維化是心臟重構(gòu)的重要組成部分，貫穿于心力衰竭發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。已知心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFBs）過(guò)度增殖，膠原合成增多，排列紊亂是心肌纖維化的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。CFBs在應(yīng)激下可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MyoFBs）[2，3]，合成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）能力增強(qiáng)。平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白。

白細(xì)胞介素-33（interleukin，IL-33）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，2005年被鑒定為白細(xì)胞介素-1（IL-1）類(lèi)家族新成員。IL-33 與其受體ST2結(jié)合后，將活化信號(hào)傳導(dǎo)到胞內(nèi)，誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與多種炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[4，5]。其中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）是IL-33介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)分子。最近研究顯示，IL-33/ST2與纖維化疾病存在密切聯(lián)系，在肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化以及皮膚纖維化等纖維化疾病中發(fā)現(xiàn) IL-33和/或ST2表達(dá)水平發(fā)生了變化。IL-33/ST2在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮的具體作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-33對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖及纖維化過(guò)程中關(guān)鍵蛋白分子表達(dá)的影響以及下游通路活化的影響，探討IL-33與心肌纖維化的關(guān)系，為進(jìn)一步明確心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制及尋求新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心臟成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。重組IL-33購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，MTT試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠α-SMA抗體、TRAF-6抗體購(gòu)自SANT CRUZ公司。兔抗大鼠ERK1/2和p-ERK1/2購(gòu)自CST公司，內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)自Biolegend公司，堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、堿磷酶底物BCIP/NBT顯色濃縮液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ERK1/2特異性阻斷劑PD98059購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自碧云天公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心臟成纖維細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以0.5×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔，每孔體積200 μL。細(xì)胞經(jīng)IL-33分別誘導(dǎo)24、48及72 h，每孔加MTT 20 μL（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加DMSO 150 μL，置搖床上低速振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解。酶聯(lián)免疫儀490 nm測(cè)吸光度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)標(biāo)記性基因 α-SMA及信號(hào)通路關(guān)鍵因子TRAF-6的mRNA表達(dá)變化 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，消化后調(diào)整密度至5×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶。無(wú)血清培養(yǎng)基同步化饑餓12 h，再以10 ng/mL IL-33誘導(dǎo)24 h，其中檢測(cè)α-SMA時(shí)用40μM PD98059預(yù)處理60 min，RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。α-SMA上游引物：5'- ACTCTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3'，下游引物：5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGCT-3'；TRAF-6上游引物：5'- TCTCCCCTGCCTTCATTGTT-3'，下游引物：5'-AGGCTGGCGAT-TTTGTGTTT-3'；β-actin上游引5'-ACGGTCACAG-GTCATCACTATCG-3'，下游引物：5'- GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察掃描并進(jìn)行電泳條帶分析，以目的條帶與β-actin條帶的比值作為目的條帶的相對(duì)值。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)α-SMA、TRAF-6、ERK1/2 和p-ERK1/2蛋白表達(dá) 細(xì)胞以10 ng/mL IL-33誘導(dǎo)24 h，其中檢測(cè)α-SMA時(shí)用40μM PD98059預(yù)處理60 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入200 μL RIPA裂解液（每1 mL裂解液中加10 μL PMSF），冰上裂解30 min，超聲，4℃、12000 rpm離心10 min，取上清。Bradford法測(cè)定蛋白含量。4∶1體積比加入上樣緩沖液，100℃ 5 min變性。每孔上樣等量總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。30v轉(zhuǎn)膜150 min，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h。TBST洗膜3次，分別加入一抗α-SMA（1∶1000稀釋?zhuān)?、TRAF-6、ERK1/2和p-ERK1/2（1∶400稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶500稀釋?zhuān)?，室溫孵? h。最后BCIP/NBT顯色液暗處顯色觀察，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，磷酸化水平用磷酸化蛋白和總蛋白的相對(duì)值表示，目的蛋白水平用目的蛋白和內(nèi)參蛋白的相對(duì)值表示。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-33對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

加入10 ng/mL IL-33刺激細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后，各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量不斷增多。MTT結(jié)果顯示，與未刺激組比較，IL-33明顯誘導(dǎo)細(xì)胞增殖（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 IL-33對(duì)TRAF-6 mRNA和蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，TRAF-6 mRNA和蛋白水平均明顯上升（P<0.05），見(jiàn)圖1和表2。表明IL-33誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞時(shí)，活化其下游信號(hào)。

2.3 IL-33對(duì)p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

Western- blot 結(jié)果顯示，IL- 33刺激心臟成纖維細(xì)胞后ERK1/2總蛋白無(wú)明顯變化，而p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組比較，有顯著性差異（P<0.05），見(jiàn)圖1和表2。表明IL-33/ST2-TRAF-6 信號(hào)通路激活后，引起下游ERK1/2通路的參與。

2.4 IL-33對(duì)α-SMA mRNA和蛋白水平的影響

α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白。我們結(jié)果顯示，IL- 33刺激成纖維細(xì)胞24 h后，α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；40 μM PD98059預(yù)處理60 min后，α-SMA水平較單純刺激組顯著減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1和表3。表明IL-33誘導(dǎo)了心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，這一過(guò)程可以被ERK1/2特異性阻斷劑所抑制。

3 討論

心力衰竭是各種危重心血管疾病的終末階段，由于心肌損傷，引起心肌間質(zhì)纖維化、心肌肥大和心功能不良，限制心肌細(xì)胞活動(dòng)，降低心室順應(yīng)性，影響心肌的收縮和舒張功能，導(dǎo)致心臟重構(gòu)[6，7]。在慢性炎癥過(guò)程中，有多種炎癥細(xì)胞參與，并釋放多種炎癥因子，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的形成并大量分泌ECM，最終導(dǎo)致纖維化[2，8-9]。因此確切認(rèn)識(shí)心肌纖維化發(fā)生機(jī)制，有針對(duì)性地采取措施，進(jìn)而有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，對(duì)心衰的早期治療也有著重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)IL-33廣泛存在于多種組織和細(xì)胞上，如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在哮喘、自身免疫性疾病、糖尿病、血管炎癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。IL-33可特異性激活ST2，ST2基因編碼產(chǎn)生兩種蛋白：跨膜形式ST2L和分泌形式sST2。在生物機(jī)械壓力的誘導(dǎo)下， 心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞均能表達(dá)ST2。在IL-33/ST2信號(hào)通路中，IL-33與ST2L、IL-1受體輔助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL-1RAcP）組成受體復(fù)合物，活化下游信號(hào)TRAF6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子相關(guān)-1（TAK1），進(jìn)而激活p38、JNK、NF-kB 等通路發(fā)揮生物學(xué)作用。sST2可負(fù)向調(diào)節(jié)IL-33/ST2通路的傳導(dǎo)[4]。有研究證實(shí)，TRAF6 是IL-33介導(dǎo)p38、JNK 和NF-kB活化的關(guān)鍵信號(hào)分子[5，11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33能誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞明顯表達(dá)TRAF-6，表明有IL-33/ST2通路的激活。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在許多心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，如心肌肥厚、心肌纖維化及心力衰竭等[13，14]。MAPK包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/應(yīng)急激活的蛋白激酶（SAPK）及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）三條通路，其中ERK1/2是心肌梗死后心室重塑的重要信號(hào)通路之一[15，16]。有研究報(bào)道，醛固酮通過(guò)激活ERK1/2 而刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖，而且抑制ERK1/2活化能抑制IL-1β 誘發(fā)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌[15-17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心臟成纖維細(xì)胞中IL-33 /ST2 通路活化后能進(jìn)一步激活下游ERK1/2通路。已知α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白，成纖維細(xì)胞增殖、活化后其表達(dá)升高。本研究通過(guò)IL- 33誘導(dǎo)建立纖維化細(xì)胞模型，在這一過(guò)程中α-SMA 基因和蛋白水平明顯表達(dá)，并且這一效應(yīng)能被ERK1 /2特異性阻斷劑PD98059所阻斷。因此，IL- 33能誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，這一過(guò)程有IL-33/ST2-TRAF-6- ERK1/2通路參與調(diào)控。當(dāng)然目前對(duì)IL-33在心肌纖維化中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明，期望能為心肌纖維化治療研究提供新思路。

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（收稿日期：2014-09-11）

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（收稿日期：2014-09-11）