慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾I2PP2A胃癌穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

師海蓉，陳瑩，李長(zhǎng)雷，邱文洪

1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

3.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，湖北 武漢 430056

慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾I2PP2A胃癌穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

師海蓉1，陳瑩1，李長(zhǎng)雷2，邱文洪3

1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北 武漢 430056；

3.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，湖北 武漢 430056

背景與目的：蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)在包括胃癌的多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，提示其可能在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探討I2PP2A的功能及其在胃癌發(fā)生中的作用，建立穩(wěn)定抑制I2PP2A基因表達(dá)的人胃癌BGC823細(xì)胞株。方法：篩選出I2PP2A基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA并構(gòu)建pGLV2-shRNA-I2PP2A慢病毒載體，酶切和測(cè)序鑒定正確后，經(jīng)病毒包裝，感染BGC823細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)鑒定I2PP2A的表達(dá)。結(jié)果：重組慢病毒質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確；RT-PCR和Western blot證實(shí)干擾I2PP2A后，BGC823細(xì)胞株中I2PP2A表達(dá)水平明顯降低，抑制率約為90%。結(jié)論：成功構(gòu)建了I2PP2A shRNA慢病毒表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定抑制I2PP2A基因表達(dá)的人胃癌BGC823細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究I2PP2A在胃癌發(fā)生中的作用提供了可靠的細(xì)胞模型。

蛋白磷酸酶2A抑制劑-2；胃癌；慢病毒；穩(wěn)定細(xì)胞株

蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)，又稱SET基因［1］、模板活化因子-1(template activating factor 1β，TAF1β)［2］等。已有研究表明I2PP2A廣泛表達(dá)于人類不同組織和細(xì)胞系，其表達(dá)異常與多種疾病相關(guān)。對(duì)胃癌組織mRNA進(jìn)行I2PP2A cDNA表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中I2PP2A表達(dá)是相應(yīng)正常組織的2倍或更高［3］。在SETCAN轉(zhuǎn)基因小鼠中伴隨有胃黏膜的自發(fā)增生與β-catenin的過(guò)表達(dá)［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中有I2PP2A的表達(dá)，且其表達(dá)水平明顯高于癌旁黏膜及正常組織，提示I2PP2A蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。為了探討I2PP2A在胃癌的發(fā)生及發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建干擾I2PP2A的慢病毒重組質(zhì)粒，建立穩(wěn)定靶向干擾I2PP2A表達(dá)的胃癌細(xì)胞株，為研究I2PP2A在胃癌發(fā)生中的作用提供了可靠的細(xì)胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

為了衡量算法的檢測(cè)精度，定義均方根誤差(Root Mean Square Error,RMSE)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

大腸桿菌DH5α、HEK293T細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞BGC823均為本室保存。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Pfu DNA polymerase購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用到的DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA marker均購(gòu)自加拿大MBI Fermentas公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；慢病毒表達(dá)系統(tǒng)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔多克隆抗體I2PP2A以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠單克隆抗體GAPDH購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。用于蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。PVDF轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA序列的設(shè)計(jì)及合成

為進(jìn)一步確定穩(wěn)定篩選是否成功，取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞提取總蛋白做Western blot分析與鑒定，結(jié)果顯示，與BGC823組相比，pGLV2-shRNA-I2PP2A的I2PP2A的表達(dá)明顯減少(P<0.01)，而pGLV2-shRNA.NC的I2PP2A表達(dá)未見(jiàn)下降。表明穩(wěn)定表達(dá)siRNA-I2PP2A細(xì)胞構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確定穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功，細(xì)胞傳至50代再次進(jìn)行鑒定，抑制效果仍非常顯著(圖3)。說(shuō)明細(xì)胞株內(nèi)I2PP2A的表達(dá)得到了穩(wěn)定抑制，成功的建立了I2PP2A表達(dá)穩(wěn)定抑制的胃癌細(xì)胞株。

表1 shRNA干擾序列Tab. 1 Sequence of shRNA oligonucleotide

1.2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測(cè)I2PP2A mRNA的表達(dá)

分別溶解正義和反義單鏈shRNA模板，取等量模板寡核苷酸及10×DNA退火緩沖液，混勻后按照如下程序進(jìn)行退火處理：95 ℃ 5 min；85 ℃ 5 min；75 ℃ 5 min；70 ℃ 5 min；得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。取pGLV2載體，經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切，并回收，將退火后的雙鏈shRNA模板與線性化的載體于22 ℃連接1 h，轉(zhuǎn)化JM 109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；收集菌液，抽提重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定(由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC。

1.2.3 慢病毒的制備及病毒滴度測(cè)定

1.2.7 CCK-8檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞增殖

柏林的博物館好看，柏林的咖喱香腸好吃，但如果你問(wèn)我在柏林漫游時(shí)，對(duì)哪里印象最深刻，我一定會(huì)回答：街頭形形色色的柏林熊！它們或呆萌，或文藝，或指明道路，或表示歡迎。這些花花綠綠、憨態(tài)可掬的“大塊頭”經(jīng)過(guò)藝術(shù)家鬼斧神工的改造，幻化為個(gè)性鮮明的城市文化符號(hào)。從2002年開(kāi)始，它們走出德國(guó)，開(kāi)啟“聯(lián)合熊熊展”的世界環(huán)游之旅。很多國(guó)家都擁有一頭代表自己國(guó)家的“柏林熊”，可愛(ài)的大熊們手牽著手，向世界呼喊著：“和平，和平！”

2.4 Western blot鑒定I2PP2A的表達(dá)

1.2.4 慢病毒感染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選

以此證明，如果我們把后進(jìn)生看作是未經(jīng)雕琢的璞玉，那么老師的責(zé)任就是把它挖掘出來(lái)，琢去那些掩蓋著它原來(lái)光輝的雜質(zhì)，使它重放光芒。

該地鐵區(qū)間隧道覆土厚16.15 m，產(chǎn)生沉降的隧道區(qū)域及聯(lián)絡(luò)通道底部土質(zhì)為④3淤泥質(zhì)粉質(zhì)黏土層。隧道下部為軟臥層，厚 8 m；軟臥層含水量較高，為45.7%；壓縮模量非常低，為2.48；標(biāo)貫擊數(shù)僅為1.6。該土層土質(zhì)蠕變性非常敏感，且自身強(qiáng)度非常低，周邊施工對(duì)土體擾動(dòng)以及對(duì)隧道沉降與收斂影響非常明顯。

收集細(xì)胞，以T R I z o l試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證R N A完整性。以基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。I2PP2A引物序列：上游引物為5’-CAGAAGAGGTCAGAATTGATCGC-3’，下游引物為5’-TGGTTGACAAATGTTGTT ACCCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為62 bp。GAPDH引物序列：上游引物為5’-CATGAGAAGTATGAC A A C A G C C T-3’，下游引物為5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為113 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小正確，無(wú)雜帶說(shuō)明無(wú)非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。組間的表達(dá)差異通過(guò)計(jì)算2-ΔΔCt予以表示。反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。I2PP2A表達(dá)抑制率(%)=(1-轉(zhuǎn)染組I2PP2A相對(duì)表達(dá)量/對(duì)照組I2PP2A相對(duì)表達(dá)量)×100%。用同樣的方法分別測(cè)定第50代子細(xì)胞系對(duì)I2PP2A的抑制率，檢測(cè)細(xì)胞傳代對(duì)shRNA抑制力的影響。

1.2.6 Western blot檢測(cè)I2PP2A蛋白的表達(dá)

培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株至第10代，收集細(xì)胞提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)37 ℃封閉60 min，加1∶1 000稀釋的抗I2PP2A蛋白的多克隆抗體4 ℃溫育過(guò)夜。TBS-T漂洗5 min×3次，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 37 ℃溫育45 min。TBS-T漂洗5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。圖像應(yīng)用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行灰度分析。

將狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(約5×l06個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)過(guò)夜后，將重組質(zhì)粒pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對(duì)照質(zhì)粒各4 μg，在LipofectamineTM2000介導(dǎo)下與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后1 d，更換10 mL含10%血清DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；分別在轉(zhuǎn)染后48和72 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行濃縮，用0.45 μm孔徑的濾器(Millipore公司產(chǎn)品)過(guò)濾，收集濾液，50 000×g離心提純獲得病毒純化液1 mL，分裝5管，每管200 μL，于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。因包裝所用病毒pGLV2-U6-puro不帶GFP不便直接觀察，實(shí)驗(yàn)選用pGLV2-U6-GFP病毒同時(shí)包裝作參照，以判定病毒的包裝滴度及目的細(xì)胞的侵染效率。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每組重復(fù)5次。分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，除去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)基100 μL，每孔避光加入10 μL CCK-8，避光培養(yǎng)2 h，檢測(cè)450 nm的吸光度(D450)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化和文化多元化的不斷深入,為推動(dòng)區(qū)域性合作與全球性發(fā)展,在多種語(yǔ)言交織下達(dá)成共識(shí),翻譯行業(yè)發(fā)展迅猛。各國(guó)對(duì)翻譯服務(wù)也出臺(tái)了一系列的標(biāo)準(zhǔn)文件,希望通過(guò)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譯文質(zhì)量進(jìn)行有效的控制。然而,相對(duì)國(guó)外比較健全的翻譯質(zhì)量管理體系,國(guó)內(nèi)翻譯市場(chǎng)準(zhǔn)入門(mén)檻較低,屢現(xiàn)壓價(jià)等惡性競(jìng)爭(zhēng),整個(gè)行業(yè)不夠規(guī)范,翻譯專業(yè)的課程設(shè)置遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)對(duì)人才的實(shí)際需求,這些問(wèn)題都給翻譯產(chǎn)出的質(zhì)量帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定

淺表層的危巖清理，采用人工配合風(fēng)鎬、撬棍、鋼釬進(jìn)行，施工作業(yè)前拴好安全繩，安全繩拴于穩(wěn)定的樹(shù)樁上或插筋上，清理時(shí)按4～6人為1作業(yè)小組，1人負(fù)責(zé)安全監(jiān)護(hù)，其余人員用風(fēng)鎬、撬棍和鋼釬進(jìn)行清撬，多組平行錯(cuò)距作業(yè)，表層的危巖清撬完成后，及時(shí)請(qǐng)地質(zhì)工程師及相關(guān)工程人員現(xiàn)場(chǎng)判定確認(rèn)處理效果，明確是否繼續(xù)進(jìn)行清撬施工，如圖2所示。

重組慢病毒質(zhì)粒pGLV2-shRNA-I2PP2A經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)，插入的基因序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致，無(wú)堿基突變(圖1)，表明慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選

病毒感染BGC823細(xì)胞24 h后，用不含病毒上清液的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入致死濃度摸索試驗(yàn)中的嘌呤霉素最佳藥物濃度(0.4 μg/mL)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。維持嘌呤霉素濃度，隔天換液，觀察。經(jīng)過(guò)3個(gè)嘌呤霉素篩選周期后，感染重組病毒組陽(yáng)性細(xì)胞存活，而未感染病毒的野生BGC823細(xì)胞組細(xì)胞幾乎全部死亡。至空白組細(xì)胞全部被殺死后(大約1周)，收集存活的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)的pGLV2-shRNAI2PP2A及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC細(xì)胞系(圖2)。

圖1 重組慢病毒質(zhì)粒的測(cè)序圖譜Fig. 1 Sequencing of recombinant lentivirus plasmid

圖2 嘌呤霉素篩選后各孔存活情況Fig. 2 Cells survival after puromycin selection

2.3 各組細(xì)胞中I2PP2A mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞提取RNA，用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞I2PP2A的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與BGC823和pGLV2-shRNA-NC兩組相比，pGLV2-shRNA-I2PP2A的I2PP2A mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而pGLV2-shRNA.NC中I2PP2A mRNA的表達(dá)與BGC823細(xì)胞相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。表明經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)作用后，BGC823細(xì)胞I2PP2A基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，抑制率為93%。細(xì)胞傳至50代再次鑒定，I2PP2A的mRNA抑制率為91%，可見(jiàn)細(xì)胞傳代對(duì)shRNA抑制力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

慢病毒侵染效率檢測(cè)表明當(dāng)慢病毒的滴度達(dá)到1×108TU/mL時(shí)，慢病毒侵染BGC823細(xì)胞的效率分別可達(dá)到75%。分別用陽(yáng)性重組病毒和對(duì)照重組病毒以此滴度感染提前1 d接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的BGC823細(xì)胞(1.5×106個(gè)細(xì)胞/孔)，同時(shí)加入終濃度為5 μg/mL的聚凝胺。24 h后，用不含病毒上清的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，加入致死濃度摸索試驗(yàn)中的嘌呤霉素最佳藥物濃度(0.4 μg/mL)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。維持嘌呤霉素濃度，隔天換液，觀察。至空白組細(xì)胞全部被殺死后(大約1周)，收集存活的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達(dá)的pGLV2-shRNA-I2PP2A及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGLV2-shRNA.NC細(xì)胞系。

采用逐孔稀釋法在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度。測(cè)定前1 d，將滴度測(cè)定所需的293T細(xì)胞接種于96孔板，每孔加3×104個(gè)細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，體積為100 μL。將慢病毒原液10 μL，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基10倍稀釋3個(gè)梯度(1∶10、1∶100、1∶1 000)后感染293T細(xì)胞，24 h后換液，72 h熒光顯微鏡觀察熒光并統(tǒng)計(jì)表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算病毒滴度。病毒滴度計(jì)算公式：病毒滴度(TU/mL)=帶熒光的細(xì)胞數(shù)目/稀釋的濃度梯度×103。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的有效靶序列，按如下結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)：pGLV2-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了CTCGAG以避免形成終止信號(hào)。正義鏈模板的5’端添加了CCGG，與AgeI酶切后形成的黏端互補(bǔ)；反義鏈模板的5’端添加了AATT，與EcoRI酶切后形成的黏端互補(bǔ)。按同樣方法設(shè)計(jì)l條陰性對(duì)照(shRNA.NC)序列(表1)。

老姆登村位于怒江東岸的碧羅雪山，海拔從1300米至2300米，6個(gè)自然村，12個(gè)村民小組。全村有317戶,1168人。村子海拔2000米以上為人工防護(hù)林及原始森林。種植業(yè)與林副業(yè)相結(jié)合，種植業(yè)尤為發(fā)達(dá)。目前村里正在實(shí)施一戶一宅的政策，村民們不能建新房，也不能加蓋房屋，因此限制了旅游發(fā)展。國(guó)家公園的建設(shè)將會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)氐穆糜螛I(yè)發(fā)展帶來(lái)機(jī)遇，但游客的到來(lái)也會(huì)破壞杜鵑林，因此，村委會(huì)制定了保護(hù)七蓮湖的規(guī)定，包括禁止亂砍亂伐，呼吁導(dǎo)游帶游客到七蓮湖時(shí)自帶煤炭來(lái)解決生活用火，并要求村民加強(qiáng)監(jiān)督。

表2 各組細(xì)胞I2PP2A mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Tab. 2 Transcription levels of I2PP2A mRNA in various groups

圖3 Western blot檢測(cè)I2PP2A蛋白的表達(dá)Fig. 3 I2PP2A protein detected by Western blot

2.5 CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的增殖

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I2PP2A穩(wěn)定抑制后對(duì)細(xì)胞的增殖在24 h即出現(xiàn)明顯抑制。與對(duì)照組相比，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞對(duì)增殖的抑制在1～4 d差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可以看出，降低I2PP2A的表達(dá)水平可有效抑制胃癌細(xì)胞BGC823的增殖能力(圖4)。

中國(guó)雖然已成為世界上第二大經(jīng)濟(jì)體，但在金融業(yè)發(fā)展水平上未能進(jìn)入世界第一效率陣營(yíng)，在金融服務(wù)及金融監(jiān)管上仍需要向世界先進(jìn)水平看齊。

圖4 CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞增殖抑制作用Fig. 4 The proliferation of stable transfection cell lines tested by CCK-8 assay

3 討 論

大量的研究表明I2PP2A廣泛表達(dá)于人類不同組織和細(xì)胞系，具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化機(jī)制，提示I2PP2A蛋白具有重要的功能，與多種生物活動(dòng)相關(guān)，如細(xì)胞周期調(diào)控［5］、細(xì)胞凋亡［6-8］、遷移［9-10］和DNA損傷修復(fù)［11］及氧化應(yīng)激［12］等多個(gè)生物過(guò)程，是重要的細(xì)胞因子，且I2PP2A的異常表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織中I2PP2A的表達(dá)水平明顯高于癌旁黏膜及正常組織，且I2PP2A在胃癌細(xì)胞株BGC823和SGC7901中均有很好的表達(dá)，與細(xì)胞的侵襲能力成正相關(guān)，提示I2PP2A蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的作用。目前研究認(rèn)為I2PP2A可通過(guò)抑制腫瘤抑制因子蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)［13-14］和轉(zhuǎn)移抑制因子nm23-H1［15］兩條通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PP2A被認(rèn)為是潛在的腫瘤抑制因子和治療靶標(biāo)［16-18］，主要通過(guò)下調(diào)在腫瘤中異常表達(dá)的Akt、β-catenin和c-myc來(lái)發(fā)揮其抑癌作用［19-21］。因此，下調(diào)在胃癌中過(guò)表達(dá)的I2PP2A可作為一個(gè)潛在的腫瘤治療的靶點(diǎn)。

畔湖鎮(zhèn)伴湖，像截舊褲腳丟在洞庭湖邊。那條青石板路終日里濕漉漉的，灑滿魚(yú)腥味。兩排舊木板房歪歪斜斜，瓦脊上這里那里粘著干枯的青苔蘚。街雖古舊，卻因船碼頭仗勢(shì)，人氣挺旺。終日里肩擔(dān)穿插，人流不斷。鎮(zhèn)政府坐落在地勢(shì)較高的街北頭，那里從前是救撈局的地盤(pán)，有一幢氣派的古建筑。后來(lái)拆了建了辦公樓。

RNAi能特異性抑制靶基因的表達(dá)，具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性、可傳播性和可遺傳性等特點(diǎn)［22］，已成為基因功能、人類疾病模型及基因治療研究的常用技術(shù)［23-24］。siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)染效率的高低，而慢病毒載體［25-26］不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，還可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到靶細(xì)胞基因組中，是目前常用的有效實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)的理想載體。本研究采用的慢病毒表達(dá)載體是以國(guó)際通用的第3代載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過(guò)一定的改建，構(gòu)成的4質(zhì)粒體系。其中，轉(zhuǎn)移載體包含轉(zhuǎn)移目的基因的慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應(yīng)基因組RNA的所有順式作用元件，并且可以單一或多重組合的穩(wěn)定或條件誘導(dǎo)性表達(dá)轉(zhuǎn)移基因或shRNA；另外，通過(guò)3個(gè)輔助質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)，提供病毒包裝所需的反式作用因子，同時(shí)采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移，從而確保產(chǎn)生的慢病毒具備良好的生物安全性。與MuLV等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體的整合更偏向于宿主細(xì)胞基因組的基因表達(dá)活躍區(qū)，激活沉默的原癌基因的概率可能比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低且U6啟動(dòng)子能在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)siRNA持續(xù)表達(dá)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中所用載體系統(tǒng)帶有抗嘌呤霉素的抗性基因，可據(jù)此對(duì)侵染細(xì)胞進(jìn)行篩選，可為方便有效獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

RT-PCR和Western blot檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的I2PP2A mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)對(duì)I2PP2A的抑制率約為90%，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在20、30和50代中，篩選出的穩(wěn)定表達(dá)株仍具有較高的抑制效果。以上結(jié)果表明針對(duì)靶基因的特異RNAi慢病毒感染后獲得了明顯的干擾效果，證實(shí)了我們構(gòu)建的RNAi慢病毒能在人胃癌細(xì)胞BGC823內(nèi)能夠高效、特異、穩(wěn)定的對(duì)I2PP2A基因產(chǎn)生抑制作用。

穩(wěn)定沉默I2PP2A的BGC823細(xì)胞系的獲得為更深入的研究I2PP2A在胃癌中的調(diào)控作用及機(jī)制提供了可靠的體外細(xì)胞模型，為研究I2PP2A蛋白生物學(xué)功能的分子機(jī)制提供了有力工具。

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Establishment of a stable gastric cancer cell line with lentivirus-mediated RNA interference for I2PP2A

SHI Hairong1,CHEN Ying1, LI Changlei2, QIU Wenhong3(1.Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China; 2.Department of Immunology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China; 3.Laboratory Animals Center, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan Hubei 430056, China)

QIU Wenhong E-mail: qiuwenhong@hotmail.com

Background and purpose:Overexpression of inhibitor of protein phosphatase 2 A-2 (I2PP2A) in many tumors including gastric cancer suggests that I2PP2A may contribute to the development of gastric cancer. To further study the biological function of I2PP2A and its role in gastric cancer, we established a BGC823 cell line for stable expression of shRNA targeting human I2PP2A gene.Methods:A double-stranded shRNA targeting the I2PP2A was designed, synthesized and was inserted into a lentivirus vector (pGLV2), and the insertion was identified by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. BGC823 cells were then transfected with the packaged recombinant lentivirus, and resistant cell clones were selected with puromycin. The expression of I2PP2A was examined using real-time PCR (RT-PCR) and Western blot.Results:Sequencing result proved that recombinant lentivirus vector pGLV2-shRNA-I2PP2A was constructed correctly. RT-PCR and Western blot results confirmed that the expression of I2PP2A was significantly down-regulated in this infected BGC823 cell line. The efficiency of siRNA interference of I2PP2A could be up to about 90%.Conclusion:A lentiviral vector carrying a shRNA targeting the I2PP2A gene is successfully constructed, and a BGC823 cell line stably expressing I2PP2A shRNA is established with this lentiviral system.

Inhibitor 2 of protein phosphatase 2A; Gastric cancer; Lentivirus; Stable cell line

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.006

R735.2

A

1007-3639(2015)05-0352-08

2014-05-27

2014-09-15）

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001082)。

邱文洪 E-mail:qiuwenhong@hotmail.com