預(yù)照射聯(lián)合siRNA抑制小鼠肺癌Survivin基因表達(dá)的研究

王利華，閻超，李烿烿，路偉

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003；

2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)放療科，山東 青島 266035；

3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院放療科，上海 200011；

4.上海市第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233

預(yù)照射聯(lián)合siRNA抑制小鼠肺癌Survivin基因表達(dá)的研究

王利華1，閻超2，李烿烿3，路偉4

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003；

2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)放療科，山東 青島 266035；

3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院放療科，上海 200011；

4.上海市第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233

背景與目的：腫瘤放化療的效果與腫瘤細(xì)胞凋亡成正相關(guān)。Survivin是凋亡抑制基因，在肺癌中過度表達(dá)，降低其表達(dá)可增加肺癌細(xì)胞凋亡。RNA干擾可以特異、高效地封閉該基因的表達(dá)。腫瘤組織接受一定劑量的照射后，也可以提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率。本研究旨在探討預(yù)照射聯(lián)合瘤內(nèi)注射siRNA對小鼠肺癌Survivin基因表達(dá)的影響。方法：將皮下移植瘤小鼠隨機(jī)分為4組：未處理組(A組)、單純siRNA瘤內(nèi)注射組(B組)、單純放射組(C組)和4 Gy預(yù)照射+siRNA瘤內(nèi)注射組(D組)。小鼠經(jīng)上述不同處理2 d后用頸椎脫臼法處死，剝離皮下移植瘤，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測Survivin基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果：B組、C組、D組Survivin基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均較A組減少，且D組與A組Survivin基因在mRNA和蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；D組處于S期的細(xì)胞比例為(2.70±0.34)%，較B組［(8.93±0.75)%］和C組［(6.71±0.51)%］明顯減少，且與A組S期細(xì)胞的比例相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)；D組腫瘤組織的細(xì)胞凋亡率為(25.6±0.65)%，較其他3組腫瘤組織的細(xì)胞凋亡率明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.82，P<0.05)。結(jié)論：預(yù)照射可增強(qiáng)siRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，使肺癌組織中Survivin基因表達(dá)水平降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加放療敏感性。

肺癌；Survivin基因；細(xì)胞凋亡；RNA干擾

目前，肺癌是世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］，并且呈現(xiàn)上升趨勢。由于其早期癥狀體征并不典型，約50%發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，確診時(shí)3/4的患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。目前肺癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療和化療，然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，肺癌的生物治療已成為繼手術(shù)、放療和化療后的第4種腫瘤治療模式。小干擾RNA技術(shù)是目前常用的比較成熟的基因敲除的方法［2］。腫瘤的形成是細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡失控的共同結(jié)果，Survivin基因是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡蛋白抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重作用，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來消除腫瘤［3］。本研究將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549接種于昆明小鼠的腋下構(gòu)建肺癌的皮下移植瘤模型［4］，然后采用預(yù)照射、小干擾RNA技術(shù)對移植瘤給予不同處理，進(jìn)而觀察預(yù)照射聯(lián)合小干擾RNA對肺癌移植瘤的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

肺癌A549細(xì)胞株由青島大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，DMEM培養(yǎng)基及TRIZOL(總RNA抽提試劑)購自美國Gibco公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，EntransterTM(動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑)由北京英格恩生物科技有限公司提供，蛋白裂解液(RIPA)購自碧云天生物技術(shù)研究所，硝酸纖維素膜購自德國Qiagen公司，BCA(蛋白質(zhì)定量試劑盒)法蛋白濃度測定液購自美國Pierce公司，蛋白顯影液購自美國Thermo公司；β-Actin抗體和Survivin抗體均為單克隆抗體，均購自上海素爾生物科技有限公司，Survivin siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Survivin siRNA的表達(dá)載體由山東賽恩斯科技有限公司合成，NucleoBond Xtra Midi Plus質(zhì)粒提取試劑盒購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。昆明小鼠20只，雄性，8周齡，體質(zhì)量20～40 g，由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 μ/mL)、鏈霉素(100 μ/mL)的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的條件下培養(yǎng)［5］。

1.2.2 荷瘤鼠模型制作及處理

收集處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用PBS配成細(xì)胞密度為5.0×107/mL的單細(xì)胞懸液。隨機(jī)分為4組：未處理組(A組)、單純siRNA瘤內(nèi)注射組(B組)、4 Gy單純放射組(C組)、4 Gy預(yù)照射+siRNA瘤內(nèi)注射組(D組)，每組5只，每只小鼠左側(cè)腋窩處皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液，2周后觀察到小鼠腋下有結(jié)節(jié)長出。

1.2.3 Survivin siRNA質(zhì)粒的體內(nèi)轉(zhuǎn)染

按照NucleoBond Xtra Midi Plus質(zhì)粒提取試劑盒的說明從菌液中抽提出質(zhì)粒載體。檢測抽出的質(zhì)粒濃度，然后用純水將質(zhì)粒濃度稀釋至0.5 μg/μL。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：

①核酸的稀釋：取100 μL的質(zhì)粒，加入10%葡萄糖溶液(w/v)150 μL，用純水50 μL補(bǔ)足至300 μL，得到葡萄糖終濃度為5%，充分混勻；②轉(zhuǎn)染試劑的稀釋：取75 μL的EntransterTM體內(nèi)試劑［6-7］用150 μL的10%葡萄糖溶液稀釋，并用純水75 μL補(bǔ)足至300 μL，得到葡萄糖終濃度為5%，充分混勻；③轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成：立即將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋后的核酸溶液中，充分振蕩混勻；④室溫靜置15 min后，將配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物一次性多點(diǎn)注射到移植瘤中［8］，轉(zhuǎn)染24 h后剝離腫塊提取RNA，轉(zhuǎn)染48 h后從腫塊中提取蛋白。

1.2.4 腫瘤組織總RNA的提取及qRT-PCR檢測mRNA含量

將小鼠麻醉然后剝離出皮下移植瘤，將組織放在液氮中保存。取少量腫瘤組織在液氮中用消毒好的研缽磨碎，每個(gè)組織中加入1 mL TRIzol試劑，常溫靜置5 min，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置2～3 min，4 ℃離心機(jī)500×g離心15 min；取上清液，加入等體積異丙醇，輕輕混勻，靜置10 min，4 ℃離心機(jī)500×g離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%冰乙醇，輕輕混勻，4 ℃離心機(jī)500×g離心5 min；棄上清液，加入10 μL DEPC水。測定總RNA濃度。按TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，使用qRT-PCR試劑盒配成20 μL所需要的反應(yīng)體系，采用2-ΔΔct方法計(jì)算Survivin基因mRNA水平的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃10 min，反應(yīng)終止后，冰上冷卻，于-20 ℃保存。PCR條件：95 ℃ 1 min預(yù)變性；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，循環(huán)30次；68 ℃延伸10 min。逆轉(zhuǎn)錄所用的引物，Survivin上游引物：5’-A G G G G G A T G T G G AGGTGTGAG-3’，下游引物：5’-CCTGT AACCCTAGAGCGGAG-3’。GAPDH上游引物：5’-CTAGAGGCACCGATGATGTTC-3’，下游引物：5’-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3’。

1.2.5 總蛋白的提取以及蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測蛋白含量

取出腫瘤組織，先用液氮在研缽中把組織研碎，用蛋白裂解液(RIPA)于冰上裂解20 min，然后將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL預(yù)冷的離心管中，4 ℃離心機(jī)500×g離心15 min，上清液用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度計(jì)算蛋白樣本的上樣量，將其加入SDS凝膠加樣緩沖液中，在100 ℃加熱3～5 min使蛋白變性。將處理后的樣品加入SDS-PAGE凝膠中開始電泳分離，80 V電泳30 min使染料進(jìn)入分離膠后，將電壓加至130 V電泳80 min，溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，然后將蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于200 mA轉(zhuǎn)膜1 h，此過程中把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜完成后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western blot洗滌液(P0023C)中，漂洗1～2 min，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。再將膜放入由脫脂奶粉、PBS和Tween-20配成的封閉液中室溫下封閉2 h，PBST洗膜3次，5 min/次，然后將膜放入稀釋好的Survivin單抗(Survivin單抗：一抗稀釋液=1∶1 000)中于4 ℃溫育過夜，PBST洗滌3次；二抗于室溫溫育2 h，PBST洗滌3次；最后加蛋白顯影液進(jìn)行掃膜，結(jié)果與參考蛋白β-actin表達(dá)做對照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將腫瘤組織用眼科剪剪切成1～2 mm大小，然后加入胰酶，37 ℃消化8 min，最后用約5 mL含血清的培養(yǎng)液終止消化，100×g離心10 min，PBS洗滌1次，用PBS配成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，100×g離心5 min后棄上清液，加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上，PBS洗滌去乙醇，100×g離心5 min，洗滌2遍，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入以PBS配成的1 mg/mL PI和10 mg/mL RNaseA至終濃度50 g/mL，37 ℃溫浴30 min，用流式細(xì)胞儀測定周期。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將腫瘤組織用眼科剪剪切成1～2 mm大小，然后加入胰酶，37 ℃消化8 min，最后用約5 mL含血清的培養(yǎng)液終止消化，100×g離心10 min，PBS洗滌1次，用PBS配成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，100×g離心5 min，加入400 μL 1×Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V混勻，避光室溫溫育15 min，加入10 μL PI染色液，混勻，冰上避光溫育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測腫瘤組織中Survivin基因mRNA的表達(dá)

對4組不同處理的小鼠的腫瘤組織提取RNA做qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，B、C、D組不同處理組的腫瘤組織中Survivin基因mRNA表達(dá)水平較未處理組減少，將3組分別與A組進(jìn)行比較得出D組腫瘤組織中Survivin基因mRNA表達(dá)降低的程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；B組和C組中Survivin基因mRNA表達(dá)降低的程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 各組Survivin基因在mRNA水平的相對表達(dá)量Fig. 1 The relative expression of Survivin gene in mRNA level of each group

2.2 Western blot檢測肺癌組織中蛋白的表達(dá)

用Western blot檢測以上4組的腫瘤組織提取蛋白，結(jié)果顯示，B、C、D組腫瘤組織中Survivin蛋白表達(dá)較A組較少；C組較B組Survivin蛋白表達(dá)水平低；D組Survivin蛋白的條帶最淡，說明該組蛋白表達(dá)水平最低(圖2)。對各組條帶進(jìn)行灰度值分析：B組/A組=0.8，C組/A組=0.4，D組/A組=0.3，說明4 Gy放療后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而增強(qiáng)對Survivin基因的干擾。

圖2 各組Survivin基因在蛋白水平的相對表達(dá)量Fig. 2 The relative expression of Survivin gene in protein level of each group

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

從不同處理的4組腫瘤組織中提取細(xì)胞做流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，處理組(B組、C組、D組)的細(xì)胞在G2期和S期的比例較未處理組(A組)減少，說明siRNA轉(zhuǎn)染或者放療后腫瘤組織中處于分裂期的細(xì)胞比例較少(圖3)。D組與A組細(xì)胞在G2期和S期的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015 1，P=0.034)，其余兩組與A組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 各組中G2期和S期細(xì)胞占該組所有細(xì)胞的比例Fig. 3 The proportion of G2and S stage in each group

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，B、C、D組的腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率較A組中的細(xì)胞凋亡率增加，說明siRNA轉(zhuǎn)染或者放療能增加腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡，且兩者聯(lián)合處理的腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率最高(表1)。

表1 各組腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡率比較Tab. 1 The comparison of apoptosis rate among different tumor tissues

3 討 論

Survivin基因是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡蛋白抑制因子［9-10］，該基因多在腫瘤組織和胚胎發(fā)育組織中表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)。目前有報(bào)道顯示，Survivin蛋白在肺鱗癌、腺癌及小細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于肺癌癌旁組織［11］，通過qRT-PCR和Western blot檢測未處理組Survivin基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)，我們也證實(shí)了Survivin基因在肺癌中的陽性表達(dá)。RNA干擾是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，這一新技術(shù)可以特異、高效地封閉Survivin基因表達(dá)［12］，本研究也采用此技術(shù)阻斷肺癌中Survivin基因的高表達(dá)。RNA干擾技術(shù)較反義核酸技術(shù)更為高效，而且siRNA質(zhì)粒能夠使siRNA在細(xì)胞內(nèi)較穩(wěn)定表達(dá)，更好地滿足臨床治療需要。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和siRNA的設(shè)計(jì)原則［13-14］，本研究構(gòu)建了Survivin siRNA干擾質(zhì)粒。目前將siRNA注入動(dòng)物移植瘤內(nèi)的技術(shù)已有較多報(bào)道［15-16］，我們構(gòu)建了小鼠肺癌皮下移植瘤模型，然后按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法將siRNA注入瘤內(nèi)。從Survivin基因mRNA的表達(dá)水平可以看出，單純siRNA轉(zhuǎn)染或者單純放射處理后Survivin基因mRNA表達(dá)水平降低，但與未處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.917 8和0.454 3)，放射聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染組的Survivin表達(dá)水平明顯降低，與未處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。故放射可以抑制Survivin的表達(dá)但作用不明顯，采用放射聯(lián)合siRNA干擾技術(shù)可以提高siRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，進(jìn)而增強(qiáng)siRNA對Survivin基因的干擾作用，降低Survivin基因的表達(dá)。Zheng等［17］采用腺病毒載體AdCMVluc的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺癌細(xì)胞照射2～40 Gy的γ線后，再感染AdCMVluc，可造成細(xì)胞內(nèi)luc基因編碼產(chǎn)物呈劑量依賴性擴(kuò)增，擴(kuò)大率可達(dá)24倍，有效抑制了腫瘤生長。Olie等［18］研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Survivin反義寡核苷酸抑制肺癌Survivin基因的表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。我們對各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)經(jīng)4 Gy放射線處理后再轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞凋亡率[(25.67±0.65%)]最高。與其他3組的凋亡率［(8.37±1.35)%、(16.39±2.29)%和(21.31±0.93)%］比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故放療聯(lián)合siRNA技術(shù)更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。根據(jù)放射線對細(xì)胞的影響，我們考慮肺癌細(xì)胞經(jīng)放射后細(xì)胞出現(xiàn)間接作用，出現(xiàn)氧自由基，細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致siRNA轉(zhuǎn)染率增加。目前關(guān)于放射增強(qiáng)siRNA的轉(zhuǎn)染率的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

Survivin基因可成為肺癌基因治療新的研究靶點(diǎn)，RNA干擾技術(shù)可以成為肺癌治療的潛在性新技術(shù)［19］，鑒于放射治療在肺癌治療中的應(yīng)用逐步擴(kuò)大［20］，價(jià)值越來越突顯，放療聯(lián)合靶向基因的RNA技術(shù)有望為肺癌的治療開辟新的前景。

［1］ BUGIANTELLA W, CAVAZZONI E, GRAZIOSI L, et al. Small bowel metastasis from lung cancer: a possible cause of acute abdomen. Case report and literature review ［J］. G Chir, 2011, 32(3): 120-122.

［2］ 李亞榮, 郝杰, 夏大文, 等. 小分子Survivin干擾RNA逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的研究［J］. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2011, 15(3): 407-410.

［3］ 葉因濤, 王晨, 宋曉坤, 等. 隱丹參酮對肝癌H22荷瘤小鼠放射增敏作用的影響［J］. 中國癌癥雜志, 2014, 24(1): 29-34.

［4］ 歷風(fēng)元, 蔣智敏, 朱漣敏, 等. 昆明小鼠肺癌模型建立的初步研究［J］. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 52(1): 17-19.

［5］ 周麗薇. 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細(xì)胞污染的方法［J］. 醫(yī)學(xué)信息, 2010, 23(11): 4387-4388.

［6］ LI X R, LI R, YAO X L, et al. Hepatitis B virus can be inhibited by DNA methyltransferase 3a via specific zincfinger-induced methylation of the X promoter ［J］. Biochemistry, 2014, 79(2): 111-123.

［7］ ZHANG Y, ZHANG L, WU J, et al. Heme Oxygenase-1 exerts a protective role in ovalbumin-induced neutrophilic airway inflammation by inhibiting response in the immune cells Th17 cell-mediated immune response ［J］. Biol Chem, 2013, 288(48): 34612-34626.

［8］ 楊捷, 徐興祥, 黃謙. AdH1-siRNA/VEGF聯(lián)合化療對小鼠Lewis肺癌的治療作用［J］. 江蘇醫(yī)藥, 2013, 39(23): 2814-2817.

［9］ HOSSAIN Z, HOSOKAWA M, TAKAHASHI K. Growth inhibition and induction of apoptosis of colon cancer cell lines by applying marine phospholipids ［J］. Nutr Cancer, 2009, 61: 123-130.

［10］ 尹虹, 劉玥, 鄭文嶺, 等. miRNA-196b過表達(dá)對K562細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin、Cox-2表達(dá)的影響［J］. 中國癌癥雜志, 2013, 23(5): 341-346.

［11］ 李姝君, 楊志雄, 田鮮艷, 等. Survivin在肺癌中表達(dá)意義及其與Fas/FasL表達(dá)的關(guān)系［J］. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2011, 8(20): 17-19.

［12］ CHEN X, QIAN Y, YAN F, et al. 5'-triphosphate-siRNA activates RIG-I-dependent type I interferon production and enhances inhibition of hepatitis B virus replication in HepG2.2.15 cells［J］. Eur J Pharmacol, 2013, 721(1-3): 86-95.

［13］ LATRONICO M V, CONDORELLI G. RNA silencing: small RNA- mediated Posttranscriptional regulation of mRNA and the implication s for heart electropathophysiology ［J］. J Cardiovasc Electrophysio, 2009, 20(2): 230-237.

［14］ LAGANA A, SHASHA D, CROCE C M. Synthetic RNAs for Gene Regulation: Design Principles and Computational Tools［J］. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2 (65): 1-7.

［15］ WANG F, ZHANG P, MA Y, et al. NIRF is frequently upregulated in colorectal cancer and its oncogenicity can be suppressed by let-7a microRNA ［J］. Cancer Lett, 2012, 314(2): 223-231.

［16］ ZHAO R, YAN Q, HUANG H, et al. Transdermal siRNATGFβ1-337 patch for hypertrophic scar treatment ［J］. Matrix Biol, 2013, 32(5): 265-276.

［17］ ZHENG W, MA X, WEI D, et al. Molecular cloning and bioinformatics analysis of a novel spliced variant of Survivin from human breast cancer cells ［J］. DNA Seq, 2005, 16(5): 321-328.

［18］ OLIE R A, SIMONES-WUST A P, BAUMANN B, et al. A novel antisense oligonucleotide targeting Survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［J］. Cancer Res, 2000, 60 (11): 2805-2809.

［19］ CHEN Y, HUANG L. Tumor-targeted delivery of siRNA by non-viral vector: safe and effective cancer therapy ［J］. Expert Opin Drug Deliv, 2008, 5(12): 1301-1311.

［20］ 馮雯, 傅小龍. 放射治療在非小細(xì)胞肺癌治療中地位［J］. 中國癌癥雜志, 2013, 23(1): 75-80.

Research on the expression of Survivin gene suppressed by pre-irradiation and intratumor injection siRNA in lung cancer of mouse

WANG Lihua1, YAN Chao2, LI Rongrong3, LU Wei4(1.Department of Oncology, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao Shandong 266003, China; 2.Department of Radiotherapy, Qilu Hospital of ShanDong University (Qingdao), Qingdao Shandong 266035, China; 3. Department of Radiotherapy, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 4.Department of Hematology, Shanghai Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200233, China)

YAN Chao E-mail: qdyanchao@aliyun.com

Background and purpose:The effects of tumor after radiotherapy and chemotherapy with tumor cell apoptosis have positive correlation. Survivin is an apoptosis suppressor gene, which is overexpressed in lung cancer. The reduction of its expression can increase lung cancer cell apoptosis. RNA interference can specifically and effectively blocked the expression of this gene. After accepting a dose of radiation, tumor tissues can raise the rate of gene transduction. The purpose of this study was to investigate the effects of the expression of Survivin gene suppressed by intratumor injection siRNA and radiation in lung cancer.Methods:Mouse subcutaneous transplanted with tumors were randomly divided into four groups: untreated group (group A), group with intratumor injection siRNA (group B), group with radiation (group C), group 4 Gy pre-irradiation combination with intratumor injection siRNA(group D). Two days later, mouse with different treatments were executed by cervical dislocation and stripped the subcutaneous tumors. mRNA and protein levels of Survivin gene were detected by quantitative real-time PCR (qRTPCR) and Western blot; Cell cycle and cell apoptosis were assayed by flow cytometry (FCM).Results:The expression of Survivin gene in mRNA and protein levels in group B, C, and D were significantly reduced compared with group A. The differences of Survivin expression in mRNA level between group A and group D were statistically significant. Compared with the other 3 groups, the expression of Survivin gene in group D was significantly reduced, the differences were statistically significant (P=0.036)；The proportion of cells in S-phase of group D was (2.70±0.34)%, compared with group B [(8.93±0.75)%] and group C [(6.71±0.51)%], that was significantly reduced. The differences of the proportion of S-phase cells in group A and group D were statistically significant (P=0.034)；The rate of cell apoptosis in group D was (25.67 ± 0.65)%, which was significantly increased compared with the rate of cell apoptosis in the other 3 groups, the differences were statistically significant (F=78.82, P<0.05).Conclusion:Pre-irradiation can enhance the transduction rate of siRNA, reduce the expression of Survivin gene in lung cancer, promote cell apoptosis, and increase the sensitivity of the radiotherapy.

Lung cancer; Survivin gene; Cell apoptosis; RNA interference

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.004

R734.2

A

1007-3639(2015)05-0339-06

2015-01-22

2015-04-01）

山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2010YY014)。

閻超 E-mail:qdyanchao@aliyun.com