TGF-β/Smads信號通路參與苦參素抑制糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及改善心功能作用

趙 娜，潘 碩，張 勇，劉小軍，官功昌，王軍奎，劉仲偉(陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710068;通訊作者，E-mail:1011111280@bjmu．edu．cn)

糖尿病在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)病率、高致死率及致殘率。研究表明，合并心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的糖尿病患者致死率增加2倍以上［1］。其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DbCM)是糖尿病所致心血管系統(tǒng)損害的重要并發(fā)癥之一，最終臨床結(jié)果表現(xiàn)為充血性心力衰竭、心源性休克以及猝死［2］。在DbCM病理進(jìn)展過程中，心肌纖維化是導(dǎo)致心臟室壁僵硬、舒張及收縮功能不全、發(fā)生難治性心力衰竭的重要機(jī)制之一［3］。

目前大量研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta one，TGF-β1)能通過激活其下游Smads蛋白，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成基因的轉(zhuǎn)錄，在心臟、肝臟、肺及腎臟等多種組織器官中參與纖維化的形成［4，5］。

苦參素(matrine)，又稱苦參堿，是存在于苦參、苦豆子以及廣豆根等多種豆科植物中的一種生物堿，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗心律失常、抗凋亡以及抗纖維化等多種生物學(xué)活性［6］。研究表明，苦參素具有較強(qiáng)的抗纖維化作用，其機(jī)制與抑制細(xì)胞因子分泌、抑制細(xì)胞增殖以及膠原合成等有關(guān)?？鄥⑺啬軌蛲ㄟ^影響 TGF-β/Smads抑制肝臟及腎臟纖維化［7］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)苦參素對糖尿病心肌病心功能具有明顯的改善作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討苦參素改善糖尿病心肌病心功能是否與改善心肌纖維化相關(guān)，并進(jìn)一步明確TGF-β/Smads信號通路是否參與上述過程，為苦參素在糖尿病心肌病臨床治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物分組與處理

將40只4周齡雄性SD大鼠(SPF級，西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，平均體重(112．44±7．62)g，隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為對照組(Ctrl)、苦參素組(Mat)、糖尿病心肌病組(DbCM)和糖尿病心肌病+苦參素組(DbCM+Mat)。以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma-Aldrich)10 mmol/L 單次腹腔注射制作大鼠糖尿病心肌病模型，注射劑量為60 mg/kg體重，以同體積生理鹽水單次腹腔注射制作大鼠對照組。根據(jù)既往研究，嚙齒類動(dòng)物血漿葡萄糖濃度＞16．7 mmol/L可認(rèn)為糖尿病心肌病模型造模成功。在造模成功后8周，采用灌胃法使用苦參素溶液(Solarbio)處理大鼠，劑量為200 mg/(kg·d)，灌胃液體積2 ml/100 g，共連續(xù)處理10 d。對照組僅予以單次腹腔注射生理鹽水，苦參組先予以單次腹腔內(nèi)注射生理鹽水，隨后應(yīng)用苦參素溶液灌胃;糖尿病心肌病組僅予以單次腹腔注射鏈脲佐菌素，糖尿病心肌病+苦參素組先予以單次腹腔注射鏈脲佐菌素，隨后應(yīng)用苦參素溶液灌胃。

1．2 血流動(dòng)力學(xué)檢測

采用頸動(dòng)脈心室內(nèi)插管法評估各組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。10%水合氯醛腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉，解剖右側(cè)頸外動(dòng)脈，插管后連接壓力換能器采集生物信號，啟動(dòng)生物信息采集系統(tǒng)(AD Instrument)生物壓力檢測模塊，檢測左室收縮壓(LVSP)以及左室舒張末壓(LVEDP)。

1．3 免疫熒光檢測大鼠心肌組織I型膠原蛋白表達(dá)水平

收集大鼠心室肌標(biāo)本，OCT包埋劑包埋后置于冷凍臺上冷凍，將組織制成厚度5 mm的冰凍切片。4%多聚甲醛中固定24 h，丙酮溶液4℃復(fù)溫10 min，PBS洗滌后，30%過氧化氫處理及5%BSA封閉后，滴加I型膠原蛋白(collagenⅠ/ColⅠ)抗體(Abcam)37℃環(huán)境處理30 min;PBS洗滌后滴加Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記二抗(Invitrogen)，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原的表達(dá)。

1．4 蛋白質(zhì)免疫印跡法評估大鼠心肌組織TGF-β/Smads信號通路活化情況

處死大鼠后收集心室肌標(biāo)本，RIPA裂解液(Santa Cruz)勻漿、離心后獲得心室肌組織總蛋白。BCA法測量組織蛋白濃度后，使用SDS-PAGE垂直電泳分離后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。15%脫脂牛奶封閉后，分別以 TGF-β1(Santa Cruz)、Smad2(Abcam)、Smad3(Abcam)、磷酸化Smad2(phospho S467，Abcam)、磷酸化Smad3(phospho S423，Abcam)以及 GAPDH(Abcam)抗體，在4℃下孵育12 h。PBST洗滌后，室溫下孵育30 min后ECL顯色法顯色，X線片曝光檢測TGF-β1、Smad2、Smad3、磷 酸 化 Smad2 及 磷 酸 化Smad3蛋白水平表達(dá)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS16．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)以及studentt檢驗(yàn)。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 苦參素對DbCM大鼠血糖及心功能的影響

與對照組相比，糖尿病心肌病組大鼠血漿葡萄糖濃度顯著升高(P＜0．05)，苦參素處理并未對血漿葡萄糖水平產(chǎn)生明顯影響(見圖1A);糖尿病心肌病組大鼠LVSP顯著降低(P＜0．05，見圖1B)，同時(shí)LVEDP水平顯著升高(P＜0．05，見圖1C)。與糖尿病心肌病組相比，糖尿病心肌病+苦參素組大鼠LVSP顯著增加(P＜0．05)，LVEDP顯著下降(P＜0．05，見圖1)。

2．2 苦參素處理對DbCM大鼠心肌纖維化的影響

心臟組織免疫熒光染色顯示，與對照組相比，糖尿病心肌病組大鼠心臟組織中Ⅰ型膠原水平顯著增加(P＜0．05，見圖2);與糖尿病心肌病組相比，糖尿病心肌病+苦參素組大鼠心臟組織內(nèi)ColⅠ水平顯著減少(P ＜0．05，見圖2)。

圖1 各組大鼠空腹血糖水平及心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Figure 1 The fasting blood glucose level and the hemodynamic index in four groups

圖2 各組心肌組織ColⅠ免疫熒光染色Figure 2 Immunofluorescence staining of collagenⅠcontent in four groups

2．3 苦參素處理對DbCM大鼠心肌組織TGF-β1/Smads信號通路的影響

各組大鼠心臟組織內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路的活化結(jié)果表明，與對照組相比，糖尿病心肌病大鼠心肌組織內(nèi) TGF-β1及ColⅠ表達(dá)水平，Smad2及Smad3的磷酸化水平均顯著增加(各組P＜0．05，見圖3);與糖尿病心肌病組相比，糖尿病心肌病+苦參素組大鼠心臟組織內(nèi)TGF-β1及ColⅠ表達(dá)水平，Smad2及Smad3的磷酸化水平均顯著減少(各組P＜0．05，見圖3)。

圖3 各組心肌組織內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路激活情況Figure 3 The expression of TGF-β1/Smads signal pathway in the groups

3 討論

DbCM指在糖尿病患者中發(fā)生的以心功能不全和心律失常為主要表現(xiàn)的特異性心肌病。DbCM中心功能不全的發(fā)生主要表現(xiàn)為心臟重塑。心臟重塑包括心肌細(xì)胞及非心肌細(xì)胞的重塑，其中非心肌細(xì)胞的重塑表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞，后者合成及分泌ECM導(dǎo)致心臟纖維化。心臟組織的ECM包括多種成分，其中Ⅰ型占80%以上［8］，其表達(dá)的增多導(dǎo)致心肌僵硬度增加，順應(yīng)性下降，最終導(dǎo)致心室收縮及舒張功能受損［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，DbCM大鼠表現(xiàn)出心臟舒張及收縮功能下降的同時(shí)伴有心肌組織中出現(xiàn)明顯的Ⅰ型膠原沉積，提示DbCM大鼠心臟纖維化參與心臟功能下降過程。

目前認(rèn)為，DbCM所致的心臟纖維化機(jī)制主要與高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、RAAS系統(tǒng)激活，內(nèi)皮素、基質(zhì)金屬蛋白酶、胰島素樣生長因子(IGF-1)以及TGF-β1表達(dá)增加等有關(guān)［10］。既往研究結(jié)果顯示，TGF-β1能夠刺激心臟成纖維細(xì)胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原，同時(shí)對膠原酶原、基質(zhì)酶原等產(chǎn)生抑制作用，最終導(dǎo)致ECM在心臟間質(zhì)沉積，促進(jìn)心臟纖維化，加重心力衰竭［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，在DbCM大鼠心肌組織中的 TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，初步證實(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的信號通路參與DbCM大鼠心臟纖維化過程。Smads蛋白是TGF-β1下游的重要信號分子，smad2及smad3磷酸化后，形成的異源寡聚體通過活化轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步上調(diào)下游膠原蛋白的表達(dá)［12］。本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DbCM大鼠心臟組織中Smad2和Smad3磷酸化水平顯著增高，進(jìn)一步證實(shí)在DbCM大鼠心肌組織中TGF-β1/Smads信號通路呈顯著活化狀態(tài)。

近年相關(guān)藥理研究表明，苦參素具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒以及抗纖維化等多種生物學(xué)活性，其抗肝臟、腎臟以及肺臟纖維化的活性均已得到研究證實(shí)及臨床應(yīng)用［13］。本研究在DbCM大鼠模型中發(fā)現(xiàn)苦參素亦能發(fā)揮抗心臟纖維化，改善心功能作用，同時(shí)對其可能的分子生物學(xué)機(jī)制做一初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參素能夠顯著抑制DbCM心臟組織中活化的TGF-β1/Smads信號通路的相關(guān)分子表達(dá)(圖3)，揭示苦參素是發(fā)揮抗纖維化作用的靶點(diǎn)之一。

總之，在DbCM的發(fā)生發(fā)展過程中，心臟纖維化在心功能的不斷惡化中扮演重要的角色。本課題發(fā)現(xiàn)苦參素通過減輕心肌纖維化改善DbCM的心功能，并證實(shí)TGF-β1/Smads信號通路是其作用的分子機(jī)制之一。研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充完善DbCM的發(fā)病機(jī)制，并為苦參素在DbCM治療中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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