連翹不同部位活性成分含量分析

李丹鳳，李石飛，張立偉(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，太原 030006;通訊作者，E-mail:lwzhang@sxu．edu．cn)

連翹(Forsythia suspensa(Thunb．)Vahl)為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物。中國藥典［1］記載，秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，習(xí)稱青翹;果實(shí)熟透時(shí)采收，曬干，除去雜質(zhì)，習(xí)稱老翹。連翹是一種傳統(tǒng)中藥，以果實(shí)入藥，具有清熱解毒，散結(jié)消腫等功效。由于歷版《中國藥典》中均未區(qū)分青翹和老翹，加上市場對連翹的需求量大，導(dǎo)致了近年來連翹的主產(chǎn)區(qū)均出現(xiàn)了“搶青”現(xiàn)象，市場上已經(jīng)少有老翹供應(yīng)了。自古以來，連翹的使用都是以老翹為主，那么現(xiàn)如今普遍地用青翹代替老翹入藥是否合理?同時(shí)，有人［2］依據(jù)2010版《中國藥典》規(guī)定連翹的指標(biāo)性成分是連翹酯苷A和連翹苷，研究出連翹葉可以替代果實(shí)入藥，這樣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否具有合理性，是否應(yīng)該提升連翹的標(biāo)準(zhǔn)而不是簡單一兩個(gè)指標(biāo)成分含量測定而已?此外，連翹早春先葉開花，花量大，花期長，花色長久不褪，具有很好的觀賞價(jià)值，其花是一種資源豐富的黃色食用色素源［3］，在民間有用連翹花泡茶的習(xí)俗。目前關(guān)于連翹不同部位化學(xué)成分的研究，多集中于連翹果實(shí)和連翹葉中，對連翹花的研究鮮有報(bào)道［4］。針對以上問題，本實(shí)驗(yàn)對連翹不同部位——花、葉、果實(shí)(青翹和老翹)中的(+)－松脂素－β－D－葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷4種成分進(jìn)行了含量分析，旨在為連翹的多標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供證據(jù)，為連翹其他藥用部位的合理利用和對連翹資源的充分開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);SB－3200 DTS超聲波掃頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);冰醋酸(色譜純，美國Fisher Scientific);甲醇(分析純，天津市北辰方正試劑廠);蘆丁(純度:98% 批號(hào):100080－200707)(中國藥品生物制品檢定所)、連翹酯苷A(純度:92．9% 批號(hào):111810－201103)(中國藥品生物制品檢定所);連翹苷、(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷為本實(shí)驗(yàn)室自制;實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

選山西大學(xué)校園內(nèi)種植的4株連翹為樣株(經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定，為木犀科連翹屬連翹)，采集部位為4株連翹的花(3月)、葉(7月)、果實(shí)［青翹(7月)和老翹(10月)］。自然陰干，粉碎成末，過篩，備用。

1．2 提取分離

(1)分別精密稱定蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品各1．0 mg，加入甲醇分別定容于10 ml容量瓶中，作為對照品溶液備用。

(2)分別精密稱定連翹花、葉、青翹、老翹的粉末各1 g，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液100 ml，稱重，超聲提取1 h，冷卻，稱重，加50%甲醇補(bǔ)足失重量。靜置，取上清液，過0．45 μm有機(jī)濾膜，取其濾液，作為供試品溶液。

1．3 色譜條件及線性方程

［5］中方法，采用Zorbax XDB C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，Zorbax XDB C18預(yù)柱(12．5 mm ×4．6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為甲醇(A)－0．3%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫(0－8 min:30%－33%甲醇;8－24 min:33%－40%甲醇;24－39 min:40%－48%甲醇;39－55 min:48%－64%甲醇)。流速為0．8 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量 10 μl。

本研究所用儀器、分析色譜柱以及流動(dòng)相條件完全參照文獻(xiàn)［5］條件，借鑒其相關(guān)線性方程(見表1)，在其線性范圍內(nèi)，對4種化合物的含量進(jìn)行測定。

表1 四種化合物的線性方程Table 1 Calibration curves of the four constituents

2 結(jié)果

2．1 含量測定

取連翹不同部位樣品—花、葉、青翹、老翹，分別作3個(gè)平行處理，按照1．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照1．3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。對照品及供試品的HPLC圖譜見圖1。

以外標(biāo)法計(jì)算，按干燥品計(jì)各供試品中的(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷的含量，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷在連翹花中的含量最高，可達(dá)到22．63 mg/g，在葉中的含量最低，僅有8．99 mg/g。連翹的主要活性成分連翹酯苷A在青翹中含量最高，可達(dá)62．28 mg/g，其次為老翹、葉和花。蘆丁和連翹苷在葉中的含量最高，分別為6．97 mg/g和45．57 mg/g。老翹中蘆丁含量僅為0．64 mg/g，葉中蘆丁為其10倍之多。花中連翹苷含量最低，為0．65 mg/g，葉中含量為其70倍之多。

圖1 對照品及供試品的HPLC圖譜Figure 1 HPLC Chromatograms of reference substances and samples

表2 供試品中四種活性成分含量測定結(jié)果(mg/g±s，n=3)Table 2 Contents of the four active constituents of samples(mg/g，±s，n=3)

表2 供試品中四種活性成分含量測定結(jié)果(mg/g±s，n=3)Table 2 Contents of the four active constituents of samples(mg/g，±s，n=3)

樣品 (+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷 連翹酯苷A 蘆丁 連翹苷花22．63 ±0．49 9．41 ±0．19 5．46 ±0．19 0．65 ±0．03葉8．99 ±0．10 40．34 ±0．83 6．97 ±0．16 45．57 ±0．61青翹 21．78 ±0．20 62．28 ±1．14 1．63 ±0．03 16．68 ±0．14老翹16．93 ±0．05 51．58 ±2．15 0．64 ±0．01 9．20 ±0．09

2．2 單因素方差分析

采用SPSS軟件對連翹不同部位中4種成分進(jìn)行了單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)果見圖2。

單因素方差分析所得均 P=0．000＜0．05，表明連翹不同部位，即花、葉和果實(shí)(青翹和老翹)中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 連翹不同部位中4種成分含量Figure 2 The contents of four constituents in different parts of Forsythia suspensa

2．3 主成分分析

對連翹花、葉、青翹和老翹中的4個(gè)成分采用SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析PCA(principal components analysis)，由主成分(t1)和主成分(t2)為橫縱坐標(biāo)構(gòu)建的得分散點(diǎn)圖可見，花位于散點(diǎn)圖左下部，葉位于散點(diǎn)圖右下部，而青翹和老翹分布于右上部，花、葉和果實(shí)中各成分含量有明顯的分離趨勢(見圖3)，說明四種成分在各部位中的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

3．1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖3 連翹不同部位中四種成分的主成分分析圖Figure 3 Principal components analysis of four constituents in different parts of Forsythia suspensa

由表1可知，隨著連翹的生長，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷四種成分在各個(gè)部位的變化趨勢各不相同。結(jié)果顯示果實(shí)(青翹和老翹)中連翹酯苷A含量最高，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷次之，蘆丁含量最低，且青翹中各成分含量均高于老翹，與高淑麗等［6］所測山西連翹的結(jié)果一致。葉中連翹苷含量最高，是花中含量的70倍，這與文獻(xiàn)［7，8］結(jié)果趨勢相同，且倍數(shù)相同。由于本實(shí)驗(yàn)所用樣品皆為校園采集的一種，受氣候、地理環(huán)境等因素的影響，與其他產(chǎn)地的連翹藥材有一定差異，如孫印石等［4］表明，連翹花中蘆丁的含量非常高，在山東各地含量最低的也可達(dá)到19．53 mg/g，大于本實(shí)驗(yàn)中的5．46 mg/g。雖然具體含量不盡相同，但花中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷＞連翹酯苷A＞蘆丁＞連翹苷的含量大小趨勢與孫印石等研究結(jié)果是一致的。

3．2 建議增加連翹質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)

據(jù)文獻(xiàn)［9］報(bào)道，連翹中所含的主要化學(xué)成分為黃酮類、苯乙醇及其苷類、木脂素類、三萜類、C6-C2天然醇類等。本實(shí)驗(yàn)所研究的(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷(木脂素類)、連翹酯苷A(苯乙醇苷類)、蘆丁(黃酮類)、連翹苷(木脂素類)為連翹的主要活性成分，具有降血壓、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用［10，11］。2010版《中國藥典》中以連翹酯苷A含量不少于0．25%和連翹苷含量不少于0．15%的標(biāo)準(zhǔn)控制連翹的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹酯苷A在含量最少的連翹花中也達(dá)到了0．9%，其他的均遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。而連翹苷的含量除了連翹花中含量不及標(biāo)準(zhǔn)，連翹葉、青翹、老翹中的含量均超過了藥典標(biāo)準(zhǔn)。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷在不同部位中的含量僅次于連翹酯苷A，不容忽視;而不同部位中蘆丁的含量差別較大。因此認(rèn)為藥典中僅以連翹苷和連翹酯苷A兩種化學(xué)成分的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并不能充分保證連翹藥材的質(zhì)量，建議中國藥典增加(+)－松脂素-β-D-葡萄糖苷和蘆丁作為連翹的指標(biāo)性成分，以多個(gè)指標(biāo)同時(shí)對藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。盡管連翹葉中連翹酯苷A和連翹苷的含量均超過了藥典規(guī)定的值，但是我們從表1中可發(fā)現(xiàn)四種成分在葉、青翹和老翹中含量變化趨勢是不一致的，連翹葉中蘆丁和連翹苷的含量相對較高，而青翹和老翹中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷和連翹酯苷A含量相對較高，可見單純的以連翹酯苷A和連翹苷含量標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)定“連翹葉代替連翹藥用具有可行性”［2］是不科學(xué)的。最后，盡管2010版《中國藥典》并未區(qū)分青翹和老翹，通過本研究可以發(fā)現(xiàn)兩者的化學(xué)成分含量是存在差異的，建議分別建立青翹和老翹的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期能更好地控制連翹產(chǎn)量和質(zhì)量，更具有實(shí)際意義。

參考文獻(xiàn):

［1］ 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典(一部)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:159－160．

［2］李志榮，楊光義，葉方，等．連翹不同藥用部位質(zhì)量比較研究［J］．中國藥業(yè)，2014，23(11):5－7．

［3］盛鋒，付蕾，李長城，等．連翹花黃色素的提取及其對光熱穩(wěn)定性的研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28(2):66－70．

［4］孫印石，王延杰，王建華．高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地連翹花中四種有效成分含量［J］．食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5(9):2791－2795．

［5］Guo H，Liu AH，Li L，et al．Simultaneous determination of 12 major constituents in Forsythia suspensa by high performance liquid chromatography-DAD method［J］．JPBA，2007，43(3):1000－1006．

［6］高淑麗，劉麗華，張陽．高效液相色譜法同時(shí)測定不同產(chǎn)地、不同炮制時(shí)間連翹和連翹葉中5種活性成分的含量［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(16):1276－1279．

［7］張飛，田粟，呂明霞，等．HPLC同時(shí)測定連翹花及葉中綠原酸等活性成分的含量［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(9):103－106．

［8］曹曉燕，王東浩，思培峰，等．連翹不同部位連翹苷含量的比較［J］．中成藥，2009，31(4):642－644．

［9］李倩，馮衛(wèi)生．連翹的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］．河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2):78－80．

［10］樸香蘭，田燕澤．連翹木脂素類成分研究現(xiàn)狀［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):2021－2023．

［11］劉明，中藥連翹的藥理作用的研究近況［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(16):2438－2439．