應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)哮喘5-LO E254K突變基因效果探析

吳曉東

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

1 引言

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指在體外快速擴(kuò)增DNA目的序列或特定基因的方法，因此又稱做基因的體外擴(kuò)增法.PCR擴(kuò)增技術(shù)正如DNA自我復(fù)制的自然過程，其特異性依賴于與靶基因目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物序列.PCR技術(shù)能快速簡便特異地檢測(cè)和擴(kuò)增任何需要的目的基因或相關(guān)DNA序列片段，并能基于DNA細(xì)胞分子起始水平的目的基因擴(kuò)增達(dá)到克級(jí)、微克、毫納克的特異性DNA目的基因片段，正因如此，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）已經(jīng)被應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域迅速而廣泛的被采納.隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，早已成為了一項(xiàng)重要的“革命性的技術(shù)”，不僅推動(dòng)了醫(yī)學(xué)遺傳與分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，而且在臨床與其他診斷技術(shù)相結(jié)合，極大地提高了臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù).

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase 5-LO）是花生四烯酸代謝途徑中非常關(guān)鍵的一個(gè)酶，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物白三烯（Leukotrienes LTs）可以引起支氣管痙攣、氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性，其生物活性強(qiáng)烈、作用時(shí)間持久，是引起哮喘的主要炎性介質(zhì).5-LO基因含有14個(gè)外顯子，mRNA全長為2568bp，文獻(xiàn)[1-2]顯示該酶基因的多態(tài)性可能與哮喘病相關(guān)聯(lián)，其cDNA760位的G突變成A，760G>A位于第六個(gè)外顯子中，在基因庫中也有記載,其對(duì)應(yīng)的254位的氨基酸由帶負(fù)電荷的谷氨酸(E)突變成帶正電荷的賴氨酸(K)，這一單核苷酸多態(tài)性（SNP）引起了電荷的改變對(duì)酶的功能或者該酶與其他酶的相互作用都有可能受影響.5-LO基因抑制劑是治療哮喘的新方法以及治愈哮喘的有效藥物，它的作用機(jī)理是通過抑制5-LO基因的作用以阻遏其下游產(chǎn)物的產(chǎn)生，通過檢測(cè)哮喘病人的5-LO基因E254k突變位點(diǎn)，研究該位點(diǎn)突變與5-LO抑制劑的藥物反應(yīng)，對(duì)臨床治療哮喘意義重大.本文介紹了一種經(jīng)濟(jì)、簡便、快速檢測(cè)哮喘患者5-LO E254K的方法，因此值得推廣.

2 研究對(duì)象和方法

2.1 研究對(duì)象

正常對(duì)照是無過敏史的正常人，哮喘患者是經(jīng)臨床診斷且知情同意后的自愿者.

2.2 試劑與儀器設(shè)備

引物是由北京賽百盛基因技術(shù)集團(tuán)有限公司生物合成、外周血中提取基因組DNA試劑盒購自北京百泰克生物集團(tuán)技術(shù)有限公司、紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技集團(tuán)有限公司、瓊脂糖購自西班牙原裝進(jìn)口、其它所需藥品和試劑均為國內(nèi)產(chǎn)品；電泳設(shè)備(北京六一儀器廠)、高速離心機(jī)、超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）、真空濃縮儀（VC-15SP）、全自動(dòng)凝膠成像儀(Tocan240)、高壓滅菌鍋、低速離心機(jī)、渦旋混合儀、eppendorf移液器、PCR儀（ABI2720）等.

2.3 引物設(shè)計(jì)

表1-1 設(shè)計(jì)的引物

等位基因特異性PCR法是利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性的特點(diǎn)，在突變型引物擴(kuò)增正常DNA模板時(shí)，延伸反應(yīng)會(huì)因磷酸酯鍵難于形成而不能進(jìn)行，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變.反之，表明有突變產(chǎn)生.將突變型引物和非突變型引物分別用于同一DNA模板的擴(kuò)增，判斷有無特定位點(diǎn)基因的特定突變[3].根據(jù)這一原理針對(duì)野生型和突變型設(shè)計(jì)3’端的堿基，一般倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計(jì)故意錯(cuò)配的堿基，用以提高引物的特異性[4].我們參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)的引物見表1-1.設(shè)計(jì)的對(duì)照用左側(cè)引物為5LOEX8S，對(duì)照用右側(cè)引物為5LOEX8A，PCR產(chǎn)物為600bp；用于檢測(cè)5-LO野生型（Glu）的左側(cè)引物為5-LO 254W，用于檢測(cè)5-LO突變型（Lys）的左側(cè)引物為5-LO 254M，共用的右側(cè)引物為5-LO EX6A，PCR產(chǎn)物為301bp.

2.4 樣本的采集與處理

收集外周血標(biāo)本，提取基因組DNA作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，具體方法如下[6]

2.4.1 白細(xì)胞的分離：

血細(xì)胞中的紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，基因組DNA要在白細(xì)胞中提取，低滲溶血法，利用白細(xì)胞對(duì)低滲液的抗性差別很大，紅細(xì)胞在0.2%NaCL溶液中極易破裂，待紅細(xì)胞完全破壞后，離心得到白細(xì)胞沉淀.即3ml全血倒入10ml離心管（1500r,5min）;血漿移入2ml的離心管剩余加0.2%NaCl到10ml,混勻（2500r,5min），棄上清加 0.2%NaCl混勻(2500r,5min)棄上清，加1ml 0.2%NaCl吸打混勻，移入1.5ml離心管（1200r,1min）,吸上清并貼標(biāo)簽-20℃保存[7].

2.4.2 基因組DNA的提?。?/p>

將上述白細(xì)胞從冰箱中取出，按基因組DNA提取試劑盒的說明操作，最后加入100ulDNA溶解液，混勻后測(cè)基因組DNA的純度和濃度.

2.5 PCR反應(yīng)體系和條件

2.5.1 PCR反應(yīng)體系

分A管和B管，分別加入野生型和突變型的引物，兩管中均加入對(duì)照用一對(duì)引物和共用的右側(cè)引物.反應(yīng)體系中加入 PCR mix(北京百泰克公司)：25μl；引物 5LO EX8S和5LO EX8A（10μM）各 1μl；引物 5-LO 254W(A管)/5-LO 254M(B管)和 5LOEX6A（10μM）各 1μl；模板（100-150ng/μl）:1μl；滅菌水：20μl，總體系 50μl.

2.5.2 PCR反應(yīng)條件

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是模擬生物體內(nèi)DNA自我復(fù)制過程，包括三個(gè)步驟，即變性、退火、延伸.變性：94-95℃加熱，使DNA雙螺旋打開，便于引物結(jié)合；退火：40-70℃使引物與模板DNA序列互補(bǔ)，形成雜交鏈；延伸72℃下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在ToqDNA聚合酶作用下將dNTP依次加引物的3’端，直到新的DNA雙鏈形成，如此反復(fù)進(jìn)行，經(jīng)30個(gè)循環(huán)可獲得230個(gè)拷貝數(shù)產(chǎn)物.本實(shí)驗(yàn)中采用以下反應(yīng)條件見表1-2：95℃預(yù)變性5分鐘，然后按95℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘循環(huán)30次，末次循環(huán)后72℃延伸10分鐘，4℃保存.

表1-2 PCR反應(yīng)條件

2.6 瓊脂糖凝膠電泳

2.6.1 制備2%瓊脂糖凝膠

首先稱取瓊脂糖2.0g，加入三角瓶中，相繼再加1﹡TAE緩沖液100ml；然后放入微波爐加熱，取出后再依次煮沸、2-3次震蕩；制膠膜具、插好梳子；等到溶液膠冷卻到60%左右后（注意不要過涼而發(fā)生凝固），將瓊脂糖融化好后，慢慢傾入本實(shí)驗(yàn)的電泳槽，此時(shí)樣品孔應(yīng)在在陰極端；最后向電泳槽中加入1xTAE緩沖液，膠面頁面高于1-2mm，瓊脂糖凝膠有效范圍如表1-3所示.

表1-3 瓊脂糖凝膠與的DNA分子的有效分離范圍

2.6.2 上樣

取PCR產(chǎn)物10μL，將吸頭垂直插入液面下，小心加入凝膠孔中；接通號(hào)電源，打開測(cè)試儀電源開關(guān)，直至出現(xiàn)氣泡（鉑金線為準(zhǔn)）.

2.6.3 染色

凝膠結(jié)束后，將凝膠小心放入EB染液中浸泡30min,于Tocan240中觀察并分析，最后將結(jié)果保存.

3 結(jié)果

3.1 基因組DNA的濃度與純度測(cè)定結(jié)果

雙擊桌面NanoDrop2000軟件按鈕，選擇應(yīng)用Nucleic Acid;確定儀器是閉合狀態(tài)；取2μLDNA溶解液點(diǎn)在微量基座上，放上下臂點(diǎn)Blank進(jìn)行空白對(duì)照；每次測(cè)量完成都要用吸水紙擦干凈.測(cè)量臺(tái)及上方的偵測(cè)部位；在SampleID位置輸入樣品名稱，取2μL混勻的樣品點(diǎn)在測(cè)量基座上，放上下臂，按Measure進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量結(jié)果如表1-4所示：

表1-4 基因組DNA濃度和純度測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)后,OD260/280所有值都在1.80-2.0之間，則表明DNA的純度較高，濃度平均為598.6ng/ul，說明基因組DNA提取質(zhì)量較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信.

3.2 凝膠電泳結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳：PCR擴(kuò)增后取PCR產(chǎn)物10ul，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR擴(kuò)增的結(jié)果,取5ulDNA markerI作為標(biāo)記，條帶分別為 600、500、400、300、200、100，見圖1.

圖1 等位基因特異性PCR法檢測(cè)5-LO E254K電泳結(jié)果

第1泳道為marker,A管加的是野生型引物，B管加的是突變型引物，第2和3泳道為同一個(gè)模板，結(jié)果顯示只有A管除了有內(nèi)參照物條帶外還有目的條帶，而B管未出現(xiàn)目的條帶說明為野生型GG；第4和5泳道為另一個(gè)模板，結(jié)果顯示為A管和B管除了有內(nèi)參照物條帶外都出現(xiàn)了目的條帶，說明是雜合突變型GA.

4 討論

研究SNPs常用的方法有測(cè)序法、酶切法和等位基因特異性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)法.測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)在于可以發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，當(dāng)一個(gè)外顯子中含有多個(gè)（5個(gè)以上）SNP位點(diǎn)時(shí)，采用測(cè)序法比較經(jīng)濟(jì)有效且直接.當(dāng)已知突變位點(diǎn)正好處于酶切位點(diǎn)時(shí)可以采用酶切法.本文介紹了等位基因特異性PCR法快速檢測(cè)5-LO基因E254K多態(tài)性的詳細(xì)步驟，本研究用的AS-PCR技術(shù)檢測(cè)重要的成敗因素在于其引物設(shè)計(jì)，利用由北京賽百盛基因技術(shù)集團(tuán)有限公司合成的引物和相關(guān)的試劑，較為簡便地成功檢測(cè)了5-LO E254K突變基因，用該方法可以直接擴(kuò)增分型，跟測(cè)序法和限制性內(nèi)切酶酶切法相比，具有經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、易行等特點(diǎn).特別適用于大批樣本單個(gè)位點(diǎn)的研究.

5-脂氧合酶是花生四烯酸代謝途徑非常關(guān)鍵的一個(gè)酶，其代謝產(chǎn)物白三烯是引起哮喘發(fā)作的一個(gè)重要的炎性介質(zhì).治療哮喘的新藥5-脂氧合酶抑制劑就是通過抑制5-脂氧合酶的作用以阻止下游產(chǎn)物白三烯的大量生成.檢測(cè)哮喘患者的5-LO E254K多態(tài)性，觀察該多態(tài)性對(duì)5-脂氧合酶抑制劑的藥物反應(yīng)，對(duì)臨床治療哮喘有非常重要的意義.本文介紹了一種快速檢測(cè)5-LO E254K多態(tài)性的方法，應(yīng)用該方法可以快速直接進(jìn)行分型，區(qū)分不同基因型的標(biāo)志性條帶都清晰可見，突變型和野生型條帶都很清晰，沒有雜帶，減少了人為誤差，電泳結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全吻合.我們經(jīng)過大批量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)摸索出了非常成熟的條件，可以用于臨床快速檢測(cè)5-LO E254K多態(tài)性.

5 前景與展望

隨著傳統(tǒng)PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)及其衍生出來的技術(shù)方法和不斷發(fā)展創(chuàng)新的新型PCR檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，這些新技術(shù)已逐漸廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)基因疾病診斷和治療研究的各個(gè)領(lǐng)域.該技術(shù)與方法的不斷完善和創(chuàng)新，必然會(huì)導(dǎo)致醫(yī)學(xué)事業(yè)的蓬勃發(fā)展.同時(shí)對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)來講，PCR技術(shù)應(yīng)用范圍將不斷的擴(kuò)大和深入，PCR檢測(cè)技術(shù)在檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)生物、診斷治療和其他各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用都會(huì)發(fā)揮其重要的作用，例如在高通量的突變基因檢測(cè)方面具有極其重要的地位.同時(shí)未來的PCR研究主要會(huì)致力于在疾病的基因診斷的方法改進(jìn)上，以及整合其他技術(shù)應(yīng)用，從而在未來臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和相關(guān)檢測(cè)和治療領(lǐng)域中產(chǎn)生質(zhì)的飛躍，促進(jìn)醫(yī)學(xué)衛(wèi)生事業(yè)出現(xiàn)令人期待的應(yīng)用前景.而本研究對(duì)哮喘突變基因的檢測(cè)方法作為PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一部分值得探討和推廣.

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