桐油主要脂肪酸定量分析方法的構(gòu)建及其應(yīng)用

賀舍予 ，鐘海雁 ，金超 ，周波

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

桐油主要脂肪酸定量分析方法的構(gòu)建及其應(yīng)用

賀舍予a,b，鐘海雁a,b，金超b，周波b

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

以十五烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，建立了通過氣相色譜儀定量分析桐油中6種脂肪酸含量的方法，并利用所建立的方法對湖北金絲、景陽桐油的脂肪酸組成進行分析。結(jié)果表明：各脂肪酸甲酯工作曲線線性相關(guān)性R2在0.979以上，回收率為98.9%～104.5%，RSD值為4.6%～7.3%；2種品種桐油中都含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、α-桐酸，其中金絲桐油中含量分別為0.018 、0.019、0.071、0.069 、0.003、0.729 g/g，景陽桐油中含量分別為0.021、0.022、0.054、0.070、0.002、0.585 g/g，金絲桐油中α-桐酸含量高于景陽桐油。

桐油；品種；脂肪酸；定量分析

油桐屬于大戟科Euphorbiaceae油桐屬Vernicia植物，是著名的工業(yè)油料樹種[1-2]，油桐籽經(jīng)機械壓榨或溶劑浸提工藝便可獲得桐油。α-桐酸是桐油脂肪酸的主要組成部分[3-4]，其結(jié)構(gòu)中的π-π共軛雙鍵使其易給出電子發(fā)生親電加成反應(yīng)，從而形成一系列結(jié)構(gòu)和功能各異的聚合物單體，因此桐油在高分子材料合成方面具有廣泛的應(yīng)用[5-6]；另外α-桐酸還可通過氧化聚合形成一層致密的油膜，該油膜具有附著力強、光澤性好、抗腐蝕、防滲透、絕緣性好等特點，因此桐油在新型油墨、新型油漆方面也具有廣泛的應(yīng)用[7-8]，桐油中α-桐酸的含量對桐油的品質(zhì)具有決定性的作用。因此，桐油中脂肪酸的分析檢測對桐油的品質(zhì)評價具有重要的意義。

桐油中脂肪酸的分析檢測方法一般采用紫外分光光度法和氣相色譜分析法。紫外分光光度法通過標(biāo)準(zhǔn)品建立工作曲線來分析各脂肪酸的含量，該方法對于不飽和度相同的脂肪酸特異性不強，另外油中的不皂化物會對檢測結(jié)果有一定的影響；氣相色譜儀因其高效的分離效能和靈敏的檢測限使其成為脂肪酸分析的常用儀器[9-10]。陽艷等[11]通過氣相色譜分析桐油的脂肪酸組成以此來判斷桐油的品質(zhì)特性，但只是利用面積歸一對脂肪酸進行半定量；陳陶靜等[12-13]運用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析不同產(chǎn)地不同季節(jié)桐油的脂肪酸組成；王發(fā)松等[14]利用GC-MS分析了金絲桐油中的脂肪酸組成，在桐油中還發(fā)現(xiàn)桐酸存在5種同分異構(gòu)體。

本研究利用氣相色譜儀，以十五烷酸為內(nèi)標(biāo)物，建立了桐油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、α-桐酸的定量分析方法，利用所建立的方法定量分析了金絲桐油和景陽桐油的脂肪酸組成，并從α-桐酸含量的角度評價了這2種桐油的品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

（1）脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：α-桐酸甲酯（Cayman美國）、十五烷酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯（Sigma 美國）。

（2）試劑：正庚烷，色譜純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇，色譜純（美國Tedia公司）；無水硫酸鈉，分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鉀，分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；石油醚，分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

（3） 儀 器（ 設(shè) 備）：OHAUS CP224C電 子 天 平（0.0001 g）（ 美 國 OHAUS）、SHIMADZUGC 2014氣相色譜儀（日本島津公司）、FOSS索氏浸提系統(tǒng)（ST310，丹麥）、粉碎研磨機（IKAA10,德國IKA）。

（4）材料：桐油樣1由金絲油桐種子制得，種子由湖北林科院提供；桐油樣2由景陽油桐種子制得，種子由湖北林科院提供。

1.2 桐油的制取

將油桐種子陰干后去殼，取35 g種仁用粉碎研磨機研磨粉碎30s，收集粉末于兩端塞有脫脂棉的濾紙筒中，用濾紙筒裝取5 g粉末，捆緊后，置于索氏浸提裝置中，將石油醚加入抽濾筒中后，運行程序提取油脂，并計算桐籽出仁率和含油率；提油程序運行完成后，收集桐油于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 脂肪酸定量分析方法的建立

以正庚烷為溶劑將各脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.1 mg/mL的溶液，分別取1.0uL進GC分析，以確定各脂肪酸甲酯的保留時間；再取1.00mL各脂肪酸甲酯標(biāo)樣溶液進行混合，取該混合液1.0uL進氣相分析。通過比對單一標(biāo)樣色譜圖和混合標(biāo)樣色譜圖確定各脂肪酸甲酯標(biāo)樣的保留時間，以保留時間對樣品峰進行定性分析。配制質(zhì)量濃度范圍為2.000～20.00mg/L的各脂肪酸甲酯混標(biāo)溶液，1.0uL進樣。以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各脂肪酸相對于內(nèi)標(biāo)物的相對響應(yīng)因子（Relative Response Factor，RRF）如式（2），依據(jù)式（3）對脂肪酸進行定量[15]。

式中：area(X)代表某種脂肪酸的峰面積；[X]代表某種脂肪酸的濃度；area(I)代表內(nèi)標(biāo)物的峰面積；[I]代表內(nèi)標(biāo)物的濃度。

通過加入1 mL某種已知濃度的脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品來測定加標(biāo)回收率。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量來計算回收率。依據(jù)式（4）對回收率進行計算。在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

式中：R為回收率；M1為實測值；M2為供試品所含被測成分量；M3為加入對照品量。

1.4 桐油脂肪酸甲酯的制備

桐油脂肪酸的甲酯化參考ISO 5509-2000[16]進行預(yù)處理，取0.0100g油樣（要準(zhǔn)確稱量）于圓底燒瓶中，加入1 mL 1 M KOH-甲醇溶液，之后于75℃條件下水浴加熱,冷凝回流10min后，冷卻至室溫后加入1 mL的C15∶0；轉(zhuǎn)移內(nèi)容物至250mL分液漏斗中，加正庚烷20mL，加水20mL，搖動待溶液分層后分液，收集酯層；并對水層再萃取1次后與第1次酯層合并，所得溶液用水洗滌至廢水呈中性為止。分離出酯層，用無水硫酸鈉干燥后，過濾，定容至100.00mL酯的正庚烷溶液。經(jīng)過甲酯化處理后，此時桐油脂肪酸甲酯濃度為0.1 mg/mL，以備分析用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 IBM SPSS statistics 19.0對數(shù)據(jù)進行分析，所有的數(shù)據(jù)進行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐桐籽含油率差異

桐籽為油桐樹的果實，包含果皮和種籽。油桐樹果實內(nèi)部的桐籽含有豐富的油脂，其提取物便是桐油。桐籽出仁率和含油率結(jié)果見表1。由表1可知，金絲油桐桐籽出仁率為57.97%，含油率為59.94%；景陽油桐桐籽出仁率為56.66%，含油率為56.29%；桐籽出仁率差值為1.31%，含油率差值達到3.65%。從桐籽的出仁率以及含油率的高低來看，金絲油桐籽桐油產(chǎn)量高于景陽油桐籽，表明不同油桐品種之間種籽含油率差異明顯。其品種不同是油桐樹種籽的含油率有差別的主要原因。選擇不同品種的油桐樹時，以含油率為重要指標(biāo)具有必要性[17]。

2.2 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的確定

在該色譜程序升溫條件下脂肪酸甲酯混標(biāo)氣

品種出仁率/%含油率/%金絲油桐57.9759.94景陽油桐56.6656.29相色譜如圖1所示。脂肪酸所含碳原子越多，則出峰越慢；混標(biāo)色譜圖出峰順序依次為十五烷酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯、α-桐酸甲酯。各脂肪酸甲酯可被較好分離，且相鄰各脂肪酸甲酯保留時間間隔較大，均在1 min以上。若樣品峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間相比，時間差小于0.1 min，則定性為同一種脂肪酸[18]。本方法分析時間為1 h左右，采用了二階梯升溫法分離程序，初始溫度較低，通過第一級快速升溫，可分離開碳原子數(shù)量有差異的脂肪酸甲酯，通過第二級緩慢升溫，可以分離出碳原子數(shù)量相同結(jié)構(gòu)不同的脂肪酸甲酯，從而使各脂肪酸甲酯，特別是α-桐酸得到完全分離。

GC(Shimadzu-2014)配備f l ame ionization detection，F(xiàn)ID檢測器（Shimadzu instruments Manufacturing, Co., Ltd. Suzhou China）；脂肪酸的分離通過SP2340石英毛細(xì)管柱來實現(xiàn)。以氮氣作載氣，進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為300℃，不分流進樣；初始柱溫50℃，保持2 min，然后以20.00℃/min升溫至170℃，保持5 min，繼而以2.00℃/min升溫至180℃，保持10min，最后以4.00℃/min升溫至220℃，保持22 min，進樣量1 uL。

2.3 各脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、RRF、精密度、回收率

在所配制濃度范圍內(nèi)，各脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、RRF、DL、QL、線性范圍見表2。在所選取濃度范圍內(nèi)工作曲線的R2＞0.979，說明在該濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性相關(guān)性較好。各脂肪酸甲酯的DL（S/N≥3）在 0.103 5～ 0.136 5 mg/kg之間，QL（S/N≥10）在0.345 1～0.455 1 mg/kg之間，適合痕量分析的要求。

桐油中各脂肪酸含量檢測精密度（RSD）結(jié)果如表2所示。桐油中α-桐酸RSD值為7.3%，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸RSD值都在5.6%以內(nèi)，都能滿足精確測量的要求。數(shù)據(jù)重復(fù)性好、精密度高，表明該方法測定桐油脂肪酸的穩(wěn)定性好。

桐油中各脂肪酸甲酯加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。桐油中α-桐酸甲酯回收率為101.9%，其他脂肪酸甲酯回收率在98.9%～104.5%之間，表明此方法準(zhǔn)確度高，可有效測定桐油中各脂肪酸。

表2 各脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程（2.000～20.00mg/L）、線性相關(guān)性、相對響應(yīng)因子、最低檢測線、最高檢測線、線性范圍、精密度、回收率?Table 2Fatty acid methylesters standard linear regression equations (2.000～20.00mg/L), R2, RRF, DL, QL, Linear ranges,RSD, Recovery

2.4 桐油的脂肪酸組成

景陽和金絲桐油經(jīng)甲酯化處理后其氣相色譜如圖2所示，與脂肪酸甲酯混標(biāo)色譜圖比對發(fā)現(xiàn)桐油含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和α-桐酸。所制取桐油經(jīng)過定量分析，其結(jié)果見表3。表3表明，在景陽桐油中各脂肪酸的含量分別為0.021、0.022、0.054、0.070、0.002、0.585 g/g；在金絲桐油中各脂肪酸的含量分別為0.018、0.019、0.071、0.069、0.003、0.729 g/g。通過對金絲桐油和景陽桐油的α-桐酸的檢測結(jié)果進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間有顯著差異（p＜0.05）。

圖2 脂肪酸甲酯氣相色譜Fig.2Fatty acid methylesters by gas chromatography FIG

表3 不同品種桐油中脂肪酸的組成?Table 3Fatty acid composition of Chinese tung oil in different cultivars g/g

經(jīng)比較桐油中α-桐酸含量發(fā)現(xiàn)金絲油桐比景陽油桐所制取桐油α-桐酸含量高，這可能是由于不同品種油桐中桐酸合成酶基因（fadx）表達差異引起的。桐酸合成酶基因是控制亞油酸轉(zhuǎn)化為桐酸的關(guān)鍵基因，其先在細(xì)胞核內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄生成mRNA，然后在細(xì)胞質(zhì)中核糖體和tRNA協(xié)作下合成桐酸合成酶，并通過使亞油酸脫氫獲得桐酸[19-20]。因此，促進桐酸合成酶基因的表達，可有效增加α-桐酸的積累，提高桐油中α-桐酸的含量，是油桐分子育種的重要內(nèi)容。此外，油桐樹的實地生長環(huán)境及桐籽采收時節(jié)與保藏環(huán)境的差異也可能對桐油品質(zhì)產(chǎn)生影響。

從表3中還可以看出金絲桐油脂肪酸總含量為0.909 g/g，景陽桐油脂肪酸總含量為0.754 g/g，說明景陽桐油中不皂化物比金絲桐油含量高，其不皂化物可能是高級脂肪醇、甾醇和碳?xì)浠衔锏?，其種類有待于進一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)桐油在儲存過程中伴隨發(fā)生的桐酸異構(gòu)化，即使在低溫密封條件下也發(fā)生，關(guān)于抑制桐油變質(zhì)的問題有待于進一步研究，探索出適合于桐油保藏的條件，對于桐油的品質(zhì)保持具有重要意義。

3 小結(jié)

本研究運用內(nèi)標(biāo)法，以十五烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，建立了通過氣相色譜儀定量分析桐油中6種脂肪酸含量的方法；各脂肪酸甲酯工作曲線線性相關(guān)性R2在0.979以上，回收率為98.9%～104.5%，RSD值為4.6%～7.3%；該方法具有實用性，能有效分離測定桐油中各脂肪酸，特別是對α-桐酸的含量進行定量分析，可從桐油脂肪酸含量的角度對桐油品質(zhì)的優(yōu)劣進行評價。

研究分析了金絲桐油和景陽桐油中6種脂肪酸的真實含量，其中α-桐酸含量分別為0.072 9、0.058 5 g/g，其含油率分別為59.94%、56.29%。金絲油桐原產(chǎn)于湖北省恩施州來鳳縣，所榨桐油色澤金黃，可牽拉成絲，故有“金絲桐油”之美稱；景陽油桐原產(chǎn)于湖北省鄖西縣景陽鄉(xiāng)，1983年經(jīng)中國科學(xué)院專家鑒定為國家優(yōu)質(zhì)植物品種。但從桐油中α-桐酸含量多少來看，金絲桐油質(zhì)量優(yōu)于景陽桐油。

[1]譚曉風(fēng). 油桐的生產(chǎn)現(xiàn)狀及其發(fā)展建議[J]. 經(jīng)濟林研究,2006, 24(3): 62-64.

[2]張玲玲, 彭俊華. 油桐資源價值及其開發(fā)利用前景[J]. 經(jīng)濟林研究, 2011, 29(2): 130-136.

[3]付梅軒, 陳 燕. 我國主要產(chǎn)區(qū)的桐油脂肪酸組成[J]. 中國油脂, 1985, (1): 2-8.

[4]付梅軒, 陳 燕. 桐油中桐酸的含量測定方法[J]. 中國油脂,1985, (1): 17-21.

[5]黃 坤, 夏建陵. 桐油及其衍生物的改性在高分子材料中的應(yīng)用進展[J]. 化工進展, 2008, 27(10): 1588-1592.

[6]余鼎聲, 張 駿, 吳 芮, 等. 桐油/豆油與苯乙烯共聚合研究[J]. 高分子材料科學(xué)與工程, 2006, 22(4): 88-90, 94.

[7]魏繡枝, 王 穎. 桐油資源的深度開發(fā)與利用[J]. 廣西林業(yè)科學(xué), 1994, 23(2): 105-106.

[8]李世中. 桐油綜合開發(fā)應(yīng)用前景廣闊[J]. 經(jīng)濟林研究, 1997,15(4): 71-72

[9]袁德義, 彭邵峰, 鄒 峰. 油茶種子脂肪酸與游離氨基酸的分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(1): 77-79.

[10]王 淵, 譚曉風(fēng), 謝 鵬. 油茶優(yōu)良無性系的理化性質(zhì)及脂肪酸的分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(6): 70-74.

[11]陽 艷, 張 敏. 湘西桐油中脂肪酸分析方法的研究[J]. 中國林副特產(chǎn), 2007, (4): 5-7.

[12]陳陶靜, 趙景嬋, 藍春波, 等. 陜南桐油中脂肪酸組成的氣質(zhì)聯(lián)用分析[J]. 中國林副特產(chǎn), 2012, (6): 13-15.

[13]傅偉昌, 顧小紅, 陶冠軍, 等. 桐油脂肪酸組成分析和甘三酯結(jié)構(gòu)判定[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008,20(6):964-968, 982.

[14]王發(fā)松, 尹智亮, 譚志偉, 等. 來鳳金絲桐油的化學(xué)組成研究[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報, 2008, 26(3): 291-293.

[15]朱勇. 茶油的脂肪酸變化及其生物酚的抗氧作用[D]. 長沙：中南林業(yè)科技大學(xué), 2013: 9.

[16]ISO 5509-2000Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids[S]. ISO copyright off i ce, 2000.

[17]王 森, 謝碧霞, 何 方. 秦嶺山區(qū)漆樹種籽含油率與脂肪酸成分分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(3): 97-101.

[18]孫漢洲, 黃麗群, 李志輝. 赤桉樹葉脂肪酸的定量分析[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報, 2005, 25(6): 104-105.

[19]汪陽東, 李 元, 李 鵬. 油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表達載體構(gòu)建[J]. 浙江林業(yè)科技, 2007, 27(2): 291-293.

[20]李 元. 油桐桐酸合成酶基因(fadx)的克隆、反義表達載體的構(gòu)建及對煙草的初步轉(zhuǎn)化[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007: 9-12.

Study and application of quantitative analysis of fatty acid of tung oil

HE She-yua,b, ZHONG Hai-yana,b, JIN Chaob, ZHOU Bob
(a. Key Lab. of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China;b. School of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The quantitative analysis methods of fatty acids, i.e. C16:0, C18, C18:1-9c, C18:2-9c12c, C18:3-9c12c15c, C18:3-9z11e13e in Chinese tung oils were developed by gas chromatography using methyl pentadecanoate as the internal standard. Then, two Chinese tung oils from Jingyang and Jinsi cultivars were analyzed by the methods. The results show that the correlation coeff i cients (R2) of all the linear regression equations of fatty acid methyl esters (FAMEs) of above fatty acid standards were higher than 0.979; the recoveries were from 98.9% to 104.5%, the RSDs were from 4.6% to 7.3%; the fatty acid contents of Jingyang and Jinsi tung oils were 0.021,0.022, 0.054, 0.070, 0.002, 0.585 g/g and 0.018, 0.019g, 0.071, 0.069, 0.003, 0.729 g/g of C16:0, C18, C18:1-9c, C18:2-9c12c, C18:3-9c12c15c, C18:3-9z11e13e, respectively, measured with the method, the content of C18:3-9z11e13e of Jinsi tung oil was higher than that of Jingyang tung oil, which means that Jinsi tung oil has a better quality.

Chinese tung oil; cultivar; fatty acid; quantitative analysis

S789；S794.3

A

1673-923X(2014)05-0083-05

2013-06-18

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201304707）

賀舍予（1990-），男，湖南望城人，碩士研究生，主要從事木本糧油加工與利用方面的研究；

E-mail：hesheyu2012@126.com

鐘海雁（1963-），男，浙江浦江人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟林產(chǎn)品加工方面的研究；

E-mail：zhonghaiyan631210@126.com

[本文編校：謝榮秀]