丹紅注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的影響及機(jī)制

， ，(.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 400；.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)

丹紅注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的影響及機(jī)制

曾海燕1，方勇2，曾高峰1
(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)

目的觀察丹紅注射液對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞促炎因子分泌的影響，并探討其機(jī)制。方法160 nmol/L佛波酯孵育THP-1巨噬細(xì)胞24 h后分為對(duì)照組、脂多糖組、丹紅組和脂多糖+丹紅組，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)液中促炎因子的含量，Western blot檢測(cè)核因子κB(NF-κB)、p65和Toll樣受體4(TLR4)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果丹紅注射液明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)釋放，下調(diào)核因子NF-κB和TLR4的表達(dá)。結(jié)論丹紅注射液抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可能與其抑制TLR4和NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

丹紅注射液； 促炎因子； 核因子κB； Toll樣受體4； 動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種以動(dòng)脈壁脂質(zhì)蓄積為特征的慢性炎癥疾病[1]。各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與As的發(fā)生和發(fā)展過程。研究證實(shí)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎癥因子可通過相互誘導(dǎo)、相互協(xié)同共同參與As的發(fā)生與發(fā)展過程[2]。丹紅注射液由丹參和紅花兩種主要藥效成分組成，功用為活血化淤、通脈舒絡(luò)，已用于臨床治療冠心病、高血壓和腦血栓形成等心血管疾病[3]。研究表明，丹紅注射液可抑制實(shí)驗(yàn)性兔As的形成，顯著降低高脂誘導(dǎo)的家兔血漿總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)水平，下調(diào)主動(dòng)脈壁上的炎性因子[4-5]。此外，靜脈輸注丹紅注射液能有效治療下肢As疾病[6]。然而，丹紅注射液的抗As機(jī)制還不甚清楚，為了進(jìn)一步研究丹紅注射液抗As的作用及可能機(jī)制，本研究用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等促炎因子，再觀察丹紅注射液對(duì)促炎因子釋放的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THP-1細(xì)胞購于中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；丹紅注射液購自菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司(10 mL/支)；佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自美國(guó)Sigma公司；小牛血清購自杭州四季青公司；TNF-α、IL-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自R&D Systems公司；核因子κB(NF-κB)、 p65兔抗人一抗購自Santa Cruze公司； Toll樣受體4(TLR4)兔抗人一抗購自R&D Systems公司；β-actin鼠抗人一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人THP-1單核細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中(37 ℃、5%CO2)。培養(yǎng)液中加10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105U/L。在每次實(shí)驗(yàn)前用160 nmol/L佛波酯(PMA)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞12 h使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、丹紅組和LPS+丹紅組。對(duì)照組不加任何干預(yù)；LPS組為培養(yǎng)液中加入LPS(10 ng/mL)培養(yǎng)24 h；丹紅組為培養(yǎng)液中加入丹紅注射液(30 mL/L)培養(yǎng)24 h；LPS+丹紅組為培養(yǎng)液中同時(shí)加入10 ng/mL LPS和30 mL/L的丹紅注射液共培養(yǎng)24 h。

1.3 ELISA測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6和IL-1β含量

參照文獻(xiàn)[7]方法：獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心去除沉淀，分裝后-20 ℃冷凍保存。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100 μL，第8孔為空白對(duì)照組；將反應(yīng)板密封置于22 ℃～25 ℃孵育60 min；洗板后每孔中分別加入第一抗體工作液100 μL；重復(fù)孵育及洗板1次；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL；再重復(fù)孵育及洗板1次；每孔加入100 μL TMB底物工作液，置于22 ℃～25 ℃孵育15 min；每孔加入100 μL終止液。在5 min內(nèi)于492 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品光密度值，對(duì)應(yīng)相應(yīng)稀釋度，以線性回歸方程計(jì)算相應(yīng)培養(yǎng)液細(xì)胞因子濃度。

1.4 Western blot檢測(cè)NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)

參照文獻(xiàn)[8]方法，提取蛋白樣品，然后加入適量SDS上樣緩沖液和10%β-巰基乙醇，100 ℃煮10 min，10%聚丙烯酰氨凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉4 h，分別加入NF-κB p65(1∶200)、TLR4(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)一抗孵育4～8 h，TBST緩沖液洗滌30 min，換液1次/10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌30 min，換液1次/10 min。用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯示于X光片。然后用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描，以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 丹紅注射液抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子釋放

THP-1巨噬細(xì)胞與LPS共同孵育后，細(xì)胞上清液中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯升高，再加入丹紅注射液后，可有效抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子釋放(P<0.05)(表1)。

2.2 丹紅注射液抑制核因子NF-κB的核轉(zhuǎn)位

與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)明顯增加，約為對(duì)照組的4倍(P<0.05)；單獨(dú)加入丹紅注射液，對(duì)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位無明顯影響；加入LPS和丹紅注射液共處理細(xì)胞組，與LPS組比較，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)明顯下降(P<0.05，圖1)。

表1丹紅注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響(n=3)

分 組TNF?α(pg/mL)IL?6(pg/mL)IL?1β(pg/mL)對(duì)照組25．17±3．3243．26±8．1715．36±2．18LPS組168．62±15．78a205．38±23．64a76．41±8．32a丹紅組24．33±6．1838．35±5．1518．38±1．97LPS+丹紅組73．51±9．75b64．48±13．66b39．12±9．05b

與對(duì)照組比較，a：P<0.05；與LPS組比較，b：P<0.05

圖1 丹紅注射液對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響(n=3)A：Western blot檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)；B：半定量分析圖. 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：丹紅組；4：LPS+丹紅組. 與對(duì)照組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，**：P<0.05

2.3 丹紅注射液抑制巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)

加入LPS后，與對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；用LPS和丹紅注射液共處理巨噬細(xì)胞后，與LPS組比較，TLR4的蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)(圖2)。

圖2 丹紅注射液對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響(n=3)A：Western blot檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)；B：半定量分析圖. 1：對(duì)照組；2：LPS組；3：丹紅組；4：LPS+丹紅組. 與對(duì)照組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，**：P<0.05

3 討 論

As是一種慢性炎癥性疾病，單核/巨噬細(xì)胞參與了As病理進(jìn)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體如SR-A、CD-36攝取氧化脂質(zhì)導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，是As斑塊始發(fā)與進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。巨噬細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)As斑塊易損性和不穩(wěn)定性均有很重要的影響。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的因子如TNF-α、IL-6和IL-1β，可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)而促進(jìn)As進(jìn)程。單核/巨噬細(xì)胞自身活動(dòng)的相關(guān)領(lǐng)域以及它們?cè)诎邏K部位與其他細(xì)胞的相互作用成為動(dòng)脈粥樣硬化新興的治療靶點(diǎn)[10]。THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞已廣泛被應(yīng)用于巨噬細(xì)胞相關(guān)的多種病理過程和疾病的研究[11]。本研究對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液處理巨噬細(xì)胞后，可明顯抑制LPS所誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放，說明丹紅注射液的抗As作用很可能與其抑制炎癥的作用有關(guān)。

史衛(wèi)國(guó)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液對(duì)擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈術(shù)后患者的IL-6、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)等物質(zhì)的活性有明顯抑制作用；對(duì)家兔的研究表明，丹紅注射液可下調(diào)體內(nèi)炎性因子誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)[4]；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，丹紅注射液可降低巨噬細(xì)胞上清中趨化因子配體16(CXCL16)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)[13]。最新的研究表明，小鼠腹膜內(nèi)注射LPS(1 mg/kg)建造全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)模型，然后在用丹紅注射液處理，可明顯減輕小鼠體內(nèi)IL-6等促炎因子的表達(dá)水平[14]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，都說明丹紅注射液具有明確的抗炎效應(yīng)。

NF-κB是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多項(xiàng)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，能與靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子部位的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB參與了炎癥過程中多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并且與As關(guān)系密切[15-16]。多種涉及機(jī)體炎癥反應(yīng)的基因，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等，在其基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中存在一個(gè)或多個(gè)κB序列，因此，NF-κB激活往往是這些基因活化的前提[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液處理細(xì)胞后，與LPS組比較，核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)明顯下降，說明丹紅注射液能有效抑制NF-κB的激活，進(jìn)而下調(diào)巨噬細(xì)胞促炎因子的釋放。

Toll樣受體(TLRs)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，Toll樣受體4(TLR4)是對(duì)LPS敏感的TLRs家族成員之一，研究表明As斑塊中TLR4的表達(dá)明顯上調(diào)，且主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞，被認(rèn)為是與人類As關(guān)系最為密切的Toll樣受體之一[18]。LPS主要是通過識(shí)別細(xì)胞膜上TLR4受體，進(jìn)而通過經(jīng)典途徑、旁路途徑和非典型途徑激活NF-κB，引起多種促炎相關(guān)基因表達(dá)的變化[19]。本研究選擇TLR4做為觀察指標(biāo)，進(jìn)一步探討丹紅注射液抑制NF-κB活化及促炎因子分泌的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液能有效抑制LPS所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)，說明丹紅注射液是通過調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB途徑發(fā)揮其抗炎作用的。

總之，本研究研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能有效抑制巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，其作用機(jī)制與丹紅注射液調(diào)控TLR4-NF-κB信號(hào)途徑有關(guān)。丹紅注射液也有降低血脂和調(diào)節(jié)體內(nèi)應(yīng)激水平的作用[4]，這些發(fā)現(xiàn)都為丹紅注射液在臨床As性疾病的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。深入探討丹紅注射液的抗炎機(jī)制，有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)治療炎癥相關(guān)性疾病的新策略。

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EffectandMechanismsofDanhongInjectiononProinflammatoryCytokinesReleasefromTHP-1MacrophagesInducedbyLipopolysaccharides

ZENG Haiyan，F(xiàn)ANG Yong，ZENG Gaofeng
(DepartmentofCardiovascularMedicine，theSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveThis study was to investigate the effect of Danhong injection on proinflammatory cytokine release from lipopolysaccharide (LPS)-induced THP-1 macrophages.MethodsHuman THP-1 macrophages were induced using phorbol-12-myristate acetate (PMA，160 nmol/L) for 24 h，then cells were divided into four groups:control group，LPS group，Danhong group and LPS+Danhong group.Secretion of proinflammatory cytokines，including tumor necrosis factor-α (TNF-α)，interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 and Toll-like receptor 4 (TLR4) were examined by Western blot.ResultsDanhong injection inhibited the release of TNF-α，IL-6 and IL-1β induced by LPS，repressed the translocation of NF-κB to the nucleus and TLR4 expression.ConclusionsDanhong injection inhibited the release of inflammatory cytokine that induced by LPS，and the mechanisms may be related to the TLR4 and NF-κB expressions.

Danhong injection; proinflammatory cytokines; nuclear factor-κB; Toll-like receptor 4; atherosclerosis

2095-1116(2014)05-0443-04

2014-03-20

衡陽市科技局項(xiàng)目資助(2103K159).

曾海燕，碩士，主治醫(yī)師,研究方向：心血管疾病的臨床診療和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)病機(jī)制及防治，E-mail:18973468460@189.cn.通訊作者曾高峰，博士，主任醫(yī)師，研究方向：心血管內(nèi)科疾病的診治和介入心臟病學(xué)研究，E-mail:qichingnudou@tom.com.

R363.1

A

(此文編輯：朱雯霞)