常山胡柚皮檸檬苦素提取工藝

劉曉政， 施堂紅， 占元毅， 嚴(yán)曉麗

（浙江省果品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，浙江 常山324200）

檸檬苦素類化合物（Limomin）是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蕓香科和楝科植物中[1-2]。柑桔屬蕓香科植物，是天然檸檬苦素化合物的主要來源[3]。大量動(dòng)物試驗(yàn)表明，檸檬苦素類物質(zhì)可以抑制由化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝癌、乳腺癌、胃癌等，且作用強(qiáng)于抗癌藥物他莫昔芬。檸檬苦素化合物在鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平、防止動(dòng)脈粥樣硬化和除蟲方面也具有明顯的效果[4-8]。

常山胡柚果實(shí)與常見的柑桔果實(shí)不同，它在中醫(yī)學(xué)上屬于涼性果品，具有清涼祛火、平喘化痰、生津止咳、健胃壯身、降血脂、抗便秘、抗衰老等特殊的藥理功效[9]。胡柚皮作為胡柚的下腳料常常被丟棄，僅有小部分用于制作胡柚果茶、果脯等，大部分被廢棄，易造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。

作者對(duì)常山胡柚皮中檸檬苦素的幾種提取方法進(jìn)行了比較研究，確定了水作為提取劑的工藝參數(shù)，為實(shí)現(xiàn)常山胡柚皮中檸檬苦素的無污染提取、促進(jìn)常山胡柚深加工的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

常山胡柚皮：將常山太公山胡柚基地的胡柚鮮果皮切塊，洗凈后置于45℃烘箱內(nèi)，烘10 h后粉碎，放入密封塑料袋中，置于干燥器內(nèi)保存。檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，上海同田生物公司產(chǎn)品，純度98.0%。甲醇、正丁醇，均為乙腈色譜純；二氯甲烷、無水乙醇、正丁醇和丙酮，均為分析純。水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ProStar230型液相色譜儀，美國(guó)瓦里安公司制造；PL403型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司制造；KQ-500DE超聲波清洗機(jī)，昆山舒美超聲儀器有限公司制造；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士布奇公司制造；數(shù)顯水浴鍋，上海銀屏儀器儀表有限公司制造；超純水器，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司制造；循環(huán)水式真空泵，河南鞏義英峪予華儀器廠制造；0.45 μm針頭過濾器，安捷倫科技有限公司制造。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檸檬苦素的測(cè)定方法

色 譜 柱 ：ZORBAX SB-C18 StableBond Analytical，4.6 mm×250 mm，5-Micron；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相乙腈與水體積比為45∶55；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm；流動(dòng)相體積流量1.0 mL/min。以標(biāo)樣的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性，定量計(jì)算檸檬苦素質(zhì)量分?jǐn)?shù)Y。

式（1）中，m為提取物所含檸檬苦素質(zhì)量（mg），M為胡柚皮樣品質(zhì)量（g）。詳見文獻(xiàn)[10-11]。

2.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液的制備

精確稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為 50、100、200、400、800 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.3 胡柚皮中檸檬苦素提取方法

詳見文獻(xiàn)[12-16]。

2.3.1 水浴提取法 準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品置于三角瓶中，加入60 mL有機(jī)溶劑，在50℃下水浴回流提取2 h；準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品置于三角瓶中，加入60 mL水，在100℃下水浴回流提取2 h。

2.3.2 超聲波提取法 準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品置于三角瓶中，加入60 mL提取液（有機(jī)溶劑或水），室溫下（25℃）超聲提取2 h。樣品提取后，提取液用濾紙過濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，立即加入2 mL乙腈洗脫溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾進(jìn)樣。用水作為提取溶劑時(shí)，樣品提取后，提取液用濾紙過濾，將濾液真空干燥至干，立即加入2 mL乙腈洗脫溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾進(jìn)樣。

2.4 單因素試驗(yàn)

考察了提取溫度（℃）、提取時(shí)間（h）和料液比（g/mL）3個(gè)因子對(duì)胡柚皮中檸檬苦素提取率的影響，每個(gè)實(shí)驗(yàn)作5次平行樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 檸檬苦素的定性分析

按照色譜條件2.1，檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的高效液相色譜如圖1所示，檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為13.756 min，樣品中檸檬苦素的保留時(shí)間為13.768 min。樣品的色譜圖峰形好，較對(duì)稱，分離效果好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在50～800 μg/mL范圍內(nèi)，按選定的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以保留時(shí)間定性，以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。在該濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為

相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，檸檬苦素的檢測(cè)限為 0.028 μg/g。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品及胡柚皮樣品圖譜Fig.1 Chromatograms of Limonin standard and sample

3.3 精密度及穩(wěn)定性

精確吸取質(zhì)量濃度為400 μg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)進(jìn)樣5次，以測(cè)得的檸檬苦素的峰面積為參數(shù)，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD （n=5）為1.64%，表明方法精密度好。精確吸取質(zhì)量濃度為50、100、200、400、800 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，每隔 2 h 進(jìn)樣一次，各進(jìn)樣5次，以測(cè)得的檸檬苦素的峰面積為參數(shù)，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）分別為2.34%、1.55%、2.91%、0.86%、0.78%， 結(jié)果均小于5%，說明檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性。

3.4 加標(biāo)回收率

精確吸取已經(jīng)定量的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，分成2組，準(zhǔn)確加入到胡柚皮樣品中。一組用有機(jī)溶劑乙醇進(jìn)行提取，另一組用水進(jìn)行提取。結(jié)果顯示用乙醇進(jìn)行提取的樣品平均回收率為92.4%，用水進(jìn)行提取的樣品平均回收率為90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.49%和2.91%。

3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

3.5.1 有機(jī)溶劑提取及水提取 選擇了二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙腈6種有機(jī)溶劑，比較不同有機(jī)溶劑對(duì)常山胡柚皮中檸檬苦素的提取得率的影響。參照試驗(yàn)方法2.3，精確稱取胡柚皮樣品2.000 g，加入60 mL有機(jī)溶劑，在50℃下水浴回流提取2 h。由圖2可知，乙醇和二氯甲烷的提取效果相近，也優(yōu)于其他的提取溶劑。二氯甲烷提取檸檬苦素的得率為2.82 mg/g，乙醇提取檸檬苦素的得率為2.97 mg/g，乙腈的提取效果最差。準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品置于三角瓶中，加入60 mL水，在100℃下水浴回流提取2 h。研究以水作為提取液時(shí)，常山胡柚皮中的檸檬苦素的得率，檸檬苦素得率為2.42 mg/g。綜合考慮成本、有機(jī)溶劑的危害等，選擇乙醇為有機(jī)溶劑提取液和水作為提取液進(jìn)行比較研究。

圖2 不同提取溶劑對(duì)檸檬苦素得率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvent on yield of Limonin

3.5.2 提取時(shí)間的比較 提取時(shí)間是影響工藝成本、工藝效率的重要因素。參照試驗(yàn)方法2.3中樣品提取方法，精確稱取胡柚皮樣品2.000 g，加入60 mL乙醇，在50℃條件水浴回流提取，研究乙醇作為提取溶劑時(shí)提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響；精確稱取胡柚皮樣品2.000 g，加入60 mL水，在100℃條件水浴回流提取，研究水提取時(shí)時(shí)間對(duì)提取效果的影響。由圖5可知，無論是乙醇提取還是水提取，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素的得率明顯上升。乙醇提取時(shí)，時(shí)間達(dá)到60 min，檸檬苦素提取得率達(dá)到最高，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，檸檬苦素提取得率變化不明顯。用水作為提取溶劑時(shí)，90 min為最佳的提取時(shí)間。

3.5.3 提取溫度的選擇 溫度是影響提取工藝的重要參數(shù)。樣品提取方法參照試驗(yàn)方法2.3進(jìn)行，料液比 1∶30（g/mL），乙醇提取時(shí)間 60 min，水提取時(shí)間90 min。用乙醇作為提取溶劑時(shí)，研究了30～70℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)檸檬苦素提取得率的影響；以水作為提取液時(shí)，研究了40～100℃范圍內(nèi)溫度的影響。由圖4可知溫度對(duì)檸檬苦素提取得率的影響較大。

圖3 提取時(shí)間對(duì)常山胡柚皮中檸檬苦素得率的影響Fig.3 Effect of extracting time on yield of Limonin

圖4 提取溫度對(duì)常山胡柚皮中檸檬苦素得率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on yield of Limonin

乙醇提取時(shí)，當(dāng)溫度到50℃時(shí)達(dá)到最佳，50～60℃時(shí)，檸檬苦素在有機(jī)溶劑中提取得率的變化不明顯；在60～70℃范圍內(nèi)，檸檬苦素的提取得率有所降低，因此選擇50℃作為最佳的提取溫度。用水作為提取溶劑時(shí)，溫度達(dá)到80℃檸檬苦素得率達(dá)到最高；溫度高于80℃時(shí)，檸檬苦素的提取得率升高不明顯。

3.5.4 料液比 通常提取液越多，提取效果越好。但過多的提取液也將造成資源的浪費(fèi)、成本的增加。參照試驗(yàn)方法2.3，研究料液比對(duì)提取效果的影響。乙醇提取時(shí)，提取溫度為50℃，提取時(shí)間60 min；水提取時(shí)，提取溫度為80℃，提取時(shí)間90 min。結(jié)果由圖5可知，用乙醇提取時(shí)，在料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，常山胡柚皮中的檸檬苦素提取得率達(dá)到最大值，隨著提取液的增多，提取得率并沒有明顯增高；用水提取時(shí)，最佳料液比為 1∶25（g/mL）。

圖5 料液比對(duì)檸檬苦素提取得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of Limonin

3.5.5 超聲波輔助提取 參照試驗(yàn)方法2.3，在室溫條件下，研究超聲輔助提取對(duì)檸檬苦素得率的影響。乙醇提取時(shí)，料液比 1∶20（g/mL），提取時(shí)間 60 min，室溫下超聲提取。 水提取時(shí)，料液比1∶25（g/mL），提取時(shí)間90 min，室溫下超聲提取。結(jié)果表明：超聲有利于常山胡柚皮中檸檬苦素的提取。超聲波的擴(kuò)散、振蕩等效應(yīng)，可以使檸檬苦素從胡柚皮中擴(kuò)散到溶劑中，縮短提取時(shí)間，提高檸檬苦素的得率。以乙醇作為提取溶劑時(shí)，檸檬苦素的得率為3.22 mg/g；以水作為提取液時(shí)，檸檬苦素的得率為2.87 mg/g。

4 結(jié)語

本文報(bào)道的常山胡柚皮中檸檬苦素的檢測(cè)體系，精密度、穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 50～800 μg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。檸檬苦素的檢測(cè)限為0.028 mg/g。加標(biāo)回收率在90%以上。

常山胡柚皮中的天然檸檬苦素的提取可以采用有機(jī)溶劑二氯甲烷和乙醇進(jìn)行提取。用乙醇作為提取溶劑，單因素最佳提取條件為溫度50℃，提取時(shí)間 60 min，料液比 1∶20（g/mL），檸檬苦素的提取得率為2.97 mg/g。用水作為提取溶劑，單因素最佳提取條件為溫度80℃，提取時(shí)間90 min，料液比1∶25（g/mL），檸檬苦素的提取得率為2.42 mg/g。超聲波輔助提取時(shí)，以乙醇作為提取溶劑，在室溫下超聲提取60 min，檸檬苦素的得率為3.32 mg/g；以水作為提取溶劑，在室溫條件下超聲提取90 min，檸檬苦素的得率為2.87 mg/g。

以水作為提取溶劑，無毒、可食、易得，有利于常山胡柚皮中檸檬苦素提取實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

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