細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

黃永惠，葉頂瓊，王運(yùn)飛（四川省隆昌縣人民醫(yī)院：.腫瘤科；.神經(jīng)內(nèi)科 6450）

骨巨細(xì)胞瘤（GCT）是一種具有潛在侵襲及惡變的良性原發(fā)性腫瘤，主要發(fā)生于20～40歲的女性，據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)GCT發(fā)病率高于西方國(guó)家［1］。GCT患者病灶主要位于骨骺，可擴(kuò)展至干骺端甚至骨干。股骨遠(yuǎn)端、橈骨遠(yuǎn)端、脛骨近端、肱骨近端、骶骨為GCT常見(jiàn)的發(fā)病部位。GCT患者約80%為良性，25%～50%患者經(jīng)治療后復(fù)發(fā)，少數(shù)病情嚴(yán)重患者會(huì)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，極少患者在放療或復(fù)發(fā)后惡變。目前，臨床上最常用Jaffe′s、Enennecking和Campanacci外科分期法來(lái)劃分GCT腫瘤期限，但這些分級(jí)并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)GCT的生物學(xué)行為。因此，需要探尋一種有效預(yù)測(cè)GCT生物學(xué)行為及預(yù)后的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)［2］。本研究對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN）-CD147、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在GCT組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并分析其與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床準(zhǔn)確判斷GCT生物學(xué)行為及預(yù)后評(píng)估提供參考，為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源選擇本院2010年2到2013年4月收治的GCT患者68例，其中男29例，女39例，年齡13～56歲，平均年齡（33.5±4.7）歲，均行手術(shù)治療。其中8例行刮除；24例行刮除+骨移植；6例行切除+骨移植；16例行切除+人工關(guān)節(jié)置換；14例行切除+植骨。病變及取材部位：脊柱6例、尺骨2例、橈骨5例、股骨23例、脛骨10例、骶骨10例、髖骨5例、指骨7例。本研究選取的標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為GCT并參照J(rèn)affe′s外科分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］：Ⅰ級(jí)25例，Ⅱ級(jí)34例，Ⅲ級(jí)9例。入選標(biāo)本均為患者手術(shù)過(guò)程中刮除或切除組織經(jīng)10%中性甲醛固定，采用石蠟包埋，Ameritool公司生產(chǎn)的切片機(jī)4μm連續(xù)切片，并進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2 試劑及設(shè)備試劑免疫組化染色試劑盒（CW0118A），濃縮型DAB試劑盒（C0168），抗原修復(fù)液（SBT10001），兔抗人CD147（10186-RP01）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、VEGF多克隆抗體（HG10008-M）均購(gòu)于北京中衫金橋公司；PBS（D3183）、蘇木精（GT-5084）均購(gòu)于西安科昊公司。Ameritool公司生產(chǎn)的切片機(jī)（DYQ-401K）、Olympus公司生產(chǎn)的顯微鏡（EXTECH-MC200）、Eppendorf公司生產(chǎn)的離心機(jī)（ROTOLAVTT細(xì)胞洗滌離心機(jī)）、GILSON公司生產(chǎn)的移液槍（Pipetman Ultra）、江蘇南通金余公司生產(chǎn)的水浴箱（CJB-S 140mm×140mm）。Siemens公司生產(chǎn)的4℃冰箱（MBC-4V368）。

1.3 方法

1.3.1 S-P染色方法 石蠟包埋后，4μm連續(xù)切片，隨后常規(guī)脫蠟置水。每張切片抗原修復(fù)處理3次，每次2min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5min，于室溫下使用3%雙氧水處理，時(shí)間為15min，以徹底將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性消除。再用PBS沖洗3次，每次5min，于室溫下滴加5%山羊血清封閉液，保持30min，將多余的液體除去。加入一抗，CD147（1∶100）、MMP-2（1∶100）、MMP-9（1∶150）、VEGF（1∶100），將其置于4℃冰箱中過(guò)夜。于37℃下孵育1h。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，加入通用的二抗后處理30min。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，加入辣根酶表決鏈霉素卵白素液后處理30min。PBS沖洗，每張切片處理3次，每次5min，DAB試劑顯色，并于顯微鏡下仔細(xì)觀察，5～15 min后水洗并終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。于高倍鏡下觀察每張切片，選取5個(gè)不同視野，觀察陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量以及染色情況，陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿或胞膜淺黃色或棕黃色，綜合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量以及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)［4］。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1分（1%～25%）、2分（＞25%～50%）、3分（＞50%～75%）、4分（＞75%）；染色程度分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分（無(wú)色）、1分（淺黃 色）、2分（黃色）、3分（棕黃色）。上述陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分級(jí)評(píng)分×染色程度分級(jí)評(píng)分后分為4個(gè)等級(jí)：0～1分為（-）、2～3分為（+）、4～5分為（++）、＞6分為（+++）。

1.3.2 胃癌微血管密度計(jì)數(shù)方法 GCT內(nèi)任一的孤立棕黃色細(xì)胞或細(xì)胞簇均視為一條單獨(dú)的血管，有無(wú)官腔以及紅細(xì)胞并不作為判定為血管的必要條件，已經(jīng)形成的肌層血管、分辨不清、染色模糊的細(xì)胞不計(jì)，于低倍鏡下找到內(nèi)含微血管最為豐富的腫瘤組織即“熱點(diǎn)”，再于高倍鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)目，取其平均值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理選擇SPSS18.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CD147、VEGF、MMP-9和患者性別、年齡、分級(jí)、預(yù)后之間的關(guān)系采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，CD147和VEGF、MMP-9、MMP-2表達(dá)的相關(guān)性采用Spearmen分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色結(jié)果分析 CD147于GCT組織中染色強(qiáng)度不一，單核機(jī)制細(xì)胞胞漿內(nèi)和包膜上主要表達(dá)呈棕黃色顆粒狀的陽(yáng)性物質(zhì)，多核巨細(xì)胞也會(huì)存在少量的表達(dá)。MMP-2、MMP-9主要表達(dá)于多核巨細(xì)胞，呈現(xiàn)胞漿著色，棕黃色為陽(yáng)性物質(zhì)，在部分單核基質(zhì)細(xì)胞中也有一定的表達(dá)。VEGF陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，多核和單核細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)。

2.2 CD147、VEGF陽(yáng)性表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析

患者性別、年齡等一般情況與CD147、VEGF陽(yáng)性表達(dá)無(wú)相關(guān)（P＞0.05）。各級(jí)Jaffe′s評(píng)級(jí)患者CD147和MMP-2陽(yáng)性表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），預(yù)后各分組患者CD147、MMP-2、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 Jaffe′s分級(jí)和預(yù)后和CD147、VEGF陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系（n）

續(xù)表1 Jaffe′s分級(jí)和預(yù)后和CD147、VEGF陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系（n）

2.3 CD147和VEGF陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)分析通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，CD147的表達(dá)和MMP-9、VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.696，P=0.025；r=0.674，P=0.000）。

3 討 論

GCT是一種常見(jiàn)的骨原發(fā)性良性腫瘤，具有一定的惡變能力，主要由單核細(xì)胞樣細(xì)胞、單核基質(zhì)細(xì)胞、多核巨細(xì)胞組成，但是上述細(xì)胞的起源和在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)作用還需臨床進(jìn)一步深入研究。另外，GCT發(fā)生和發(fā)展涉及眾多細(xì)胞因子以及信號(hào)通路，其相關(guān)作用機(jī)制也尚未闡明。臨床上治療GCT首選方式為手術(shù)治療，但術(shù)后患者仍存在復(fù)發(fā)及惡變的可能［5］。

1982年Biswas發(fā)現(xiàn)CD147屬于免疫球蛋白超家族成員且廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，為多效性分子，在胎兒的發(fā)育以及視網(wǎng)膜功能方面起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)，胸腺T細(xì)胞的發(fā)展，淋巴細(xì)胞應(yīng)答程序、組織重建、空間認(rèn)知、精子發(fā)生等都有密切關(guān)系［6］。除了上述作用之外，CD147還在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面。（1）促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；（2）誘導(dǎo)腫瘤血管的生成；（3）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的錨著非依賴性生長(zhǎng)。CD147在腫瘤發(fā)展過(guò)程中還可以刺激并誘導(dǎo)MMP的生成，近年研究發(fā)現(xiàn)，CD147還能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP［7］。

體內(nèi)外臨床研究顯示，CD147表達(dá)和VEGF誘導(dǎo)具有十分密切的關(guān)系，CD147過(guò)度表達(dá)時(shí)可刺激腫瘤生長(zhǎng)及血管生成。對(duì)于CD147糖基化的研究報(bào)道顯示，CD147功能和附著糖的類型與腫瘤存在直接聯(lián)系，由此可推測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)在CD147糖基化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)考慮到MMP的表達(dá)誘導(dǎo)也需要糖基化，由此提示，糖基化過(guò)程可能是調(diào)控CD147的重要機(jī)制，可作為今后治療方向進(jìn)行研究［8］。

近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床研究證實(shí)了腫瘤的組織學(xué)表現(xiàn)和生物學(xué)行為之間存在不一致性，Jaffe′s分級(jí)以及Enneking影像學(xué)分級(jí)雖具有判定GCT局部浸潤(rùn)的作用，但是無(wú)法預(yù)測(cè)其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，患者性別、年齡等一般資料與CD147、VEGF陽(yáng)性表達(dá)無(wú)相關(guān)（P＞0.05）。由此說(shuō)明患者年齡、性別不能作為判斷GCT侵襲以及復(fù)發(fā)的指標(biāo)。各級(jí)Jaffe′s患者CD147和MMP-2陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），預(yù)后各分組患者CD147、MMP-2、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示CD147、MMPs、GCT侵襲和預(yù)后有關(guān)，可作為臨床評(píng)估GCT患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。另外，CD147和VEGF、MMP-9等因子表達(dá)呈正相關(guān)，此結(jié)論和宮頸癌等腫瘤組織情況相似，由此提示CD147可能促進(jìn)VEGF的表達(dá)，并通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移提供有利條件［8］。

綜上所述，CD147的陽(yáng)性表達(dá)和GCT患者病情惡化以及復(fù)發(fā)有著密切的關(guān)系，并且和MMP-9、VEGF的陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)，是目前臨床上評(píng)價(jià)GCT惡性程度以及評(píng)估預(yù)后的重要檢測(cè)指標(biāo)。

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