白癜風(fēng)皮膚組織角質(zhì)形成細(xì)胞釋放警報(bào)素分子的研究＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（西安710061） 牟寬厚 李 盼

白癜風(fēng)是一種常見的原發(fā)性、獲得性皮膚色素脫失性皮膚、粘膜疾病，以大小不等、數(shù)目不定的色素完全脫失斑為典型皮損［1］。目前認(rèn)為其發(fā)病是多基因遺傳、在多種內(nèi)外因子的激發(fā)下表現(xiàn)為免疫功能紊亂，導(dǎo)致表皮黑素細(xì)胞破壞，終至色素脫失［2－4］。目前關(guān)于白癜風(fēng)的研究多集中在黑素細(xì)胞上。作為構(gòu)成皮膚重要組成細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子（IL－1、TNF－α、IL－6、bFGF、ET－1等）從而影響黑素細(xì)胞增殖分化。因此角質(zhì)形成細(xì)胞在白癜風(fēng)的研究上也越來越受關(guān)注。高遷移率蛋白B1（HMGB1）是一種核內(nèi)蛋白，其組成性表達(dá)于各種組織細(xì)胞的胞核內(nèi)，具有多種重要的核內(nèi)功能［5－7］。外源性的HMGB1還能促進(jìn)人永生化有質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）增殖。但是HaCaT如何釋放HMGB1尚不清楚。本研究重點(diǎn)討論角質(zhì)形成細(xì)胞如何釋放內(nèi)源性的HMGB1并闡明HMGB1在白癜風(fēng)發(fā)病中的可能作用及機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 ①病例資料：10例患者均來自于我科門診近半年來診治的非節(jié)段型白癜風(fēng)患者，均為男性，年齡35～40歲。且近兩周未用過免疫調(diào)節(jié)劑等藥物?；顧z皮膚組織取自病人的腰腹部，直徑為5mm。7例對照組皮膚組織取自包皮環(huán)切術(shù)的正常健康人。②主要試劑：HaCaT細(xì)胞系本室常規(guī)保存。兔抗人HMGB1抗體購自Abcam公司，Alexa－488標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，兔抗人cleaved caspase3抗體購自 Cell signal公司。Amicon－Ultra－4 10K離心管購自Millipore公司。重組人TNF－α、IFN－γ購自Peprotech公司。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng)，隔天傳代。②Western－blot檢測 HMGB1釋放：HaCaT細(xì)胞（3×106）提前接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別使用以下處理方法：TNF－α（20ng／ml）和IFN－γ（40ng／ml）刺激24h；UV照射1min；4μmol／L的喜樹堿處理24h；反復(fù)凍融細(xì)胞3次誘導(dǎo)壞死。將上清收集后，使用 Amicon－Ultra－4 10K 離心管濃縮上清培養(yǎng)液，使用等體積的上清濃縮液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉2h后，兔抗人HMGB1（1∶1000）抗體孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育1h。使用化學(xué)發(fā)光法，經(jīng)化學(xué)發(fā)光儀檢測結(jié)果。③免疫熒光染色法檢測白癜風(fēng)皮膚組織的HMGB1和半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase－3）表達(dá)：將白癜風(fēng)病人的活檢皮膚組織和對照組包皮環(huán)切術(shù)的包皮組織4%多聚甲醛固定24h后、20%和30%的蔗糖脫水后，4%多聚甲醛后固定24h。OTC包埋組織，制作10μm的冰凍切片，－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。免疫染色時(shí)，使用0．2%的TritonX－100處理10min；漂洗后，10%的山羊血清室溫封閉1h；加入兔抗人的HMGB1抗體（1∶100）或者兔抗人的cleaved caspase－3抗體（1∶400）置于濕盒中4℃過夜；Alexa488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200）避光置于室溫孵育1h；4＇，6－二脒基－2－苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液處理15min；50%甘油封片；共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結(jié)果。

結(jié) 果

1 損傷的HaCaT細(xì)胞可以釋放HMGB1 HaCaT細(xì)胞經(jīng)過不同處理后，上清中蛋白經(jīng)過濃縮后經(jīng)檢測均表達(dá)HMGB1，在25kD處有明顯條帶。如圖1，凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能檢測到HMGB1（泳道3）；紫外線照射（泳道4）、TNF－α和IFN－γ細(xì)胞因子刺激（泳道5）、細(xì)胞反復(fù)凍融（泳道6）皆能誘導(dǎo)凋亡。未處理的培養(yǎng)上清（泳道1）和HaCaT全細(xì)胞裂解液（泳道2）作為陰性對照和陽性對照。

圖1 Western－blot檢測HaCaT經(jīng)處理后HMGB1的表達(dá)

2 HMGB1在白癜風(fēng)組織中由細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿釋放 白癜風(fēng)皮膚組織及對照皮膚組織經(jīng)過熒光染色，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察HMGB1的表達(dá)。如圖2所示：綠色為HMGB1，藍(lán)色為細(xì)胞核。在正常包皮皮膚中，HMGB1表達(dá)在表皮層的角質(zhì)形成細(xì)胞核內(nèi)，與藍(lán)色的細(xì)胞核共定位。在白癜風(fēng)皮損區(qū)的皮膚中，HMGB1由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中，部分HMGB1有可能釋放至細(xì)胞外。

圖2 免疫熒光檢測HMGB1在正常皮膚和白癜風(fēng)皮膚中的表達(dá)（×400）

3 白癜風(fēng)皮膚組織中角質(zhì)形成細(xì)胞趨向于凋亡為了證明在白癜風(fēng)組織中HMGB1由趨向于凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞釋放，我們對于正常皮膚組織和白癜風(fēng)皮膚組織進(jìn)行免疫熒光染色，如圖3所示：綠色為cleaved caspase－3，藍(lán)色為細(xì)胞核。在正常的皮膚中，cleaved caspase－3幾乎沒有表達(dá)；而在白癜風(fēng)皮損區(qū)皮膚角質(zhì)層，有明顯的cleaved caspase－3表達(dá)。

圖3 免疫熒光檢測cleaved caspase－3在正常皮膚和白癜風(fēng)皮膚中的表達(dá)（×400）

討 論

盡管白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但現(xiàn)在越來越多的研究表明白癜風(fēng)是一種自身免疫病，與免疫相關(guān)分子有著重要的聯(lián)系［3］。HMGB1作為一種核蛋白，它在受到炎癥刺激時(shí)能夠釋放至胞外，它的胞外功能越來越受到重視。角質(zhì)形成細(xì)胞也不單單被認(rèn)為是一種組成角質(zhì)層的細(xì)胞，多種Toll樣受體，例如TLR2，TLR4等在角質(zhì)形成細(xì)胞表面均有表達(dá)［8］，甚至有些文獻(xiàn)認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞是一種特殊的抗原提呈細(xì)胞（APC）［9］。本文著重研究角質(zhì)形成細(xì)胞如何釋放HMGB1。HMGB1一般由凋亡的細(xì)胞或者壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放或者在受到炎癥刺激時(shí)主動(dòng)分泌。在本研究中，我們使用藥物凋亡誘導(dǎo)劑、紫外線照射、細(xì)胞因子刺激、反復(fù)凍融等誘導(dǎo)凋亡和壞死，我們發(fā)現(xiàn)HaCaT可以釋放HMGB1。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道HaCaT內(nèi)源性表達(dá)HMGB1，外源性的HMGB1能夠影響HaCaT的增殖等生物學(xué)作用［10］，但是這篇文獻(xiàn)忽視了HMGB1的釋放。恰恰是胞外的HMGB1起著重要的作用。作為警報(bào)素分子（alarmin），HMGB1在機(jī)體受到損傷時(shí)能夠釋放，很有可能結(jié)合角質(zhì)形成細(xì)胞表面的Toll樣受體，釋放IL－1和IL－6等細(xì)胞因子，介導(dǎo)白癜風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展。

為了證明HMGB1在白癜風(fēng)中的作用，我們檢測了白癜風(fēng)組織中HMGB1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在白癜風(fēng)的組織中，HMGB1可以由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿，可以推斷的是，部分HMGB1已經(jīng)釋放到了胞外發(fā)揮作用。在白癜風(fēng)的組織中，我們檢測到了代表凋亡的cleaved caspase－3，也證明了在白癜風(fēng)中，HMGB1是由凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的。

綜上所述，我們在體外證明了角質(zhì)形成細(xì)胞能夠在凋亡或者壞死的情況下釋放HMGB1；在白癜風(fēng)組織中，角質(zhì)形成細(xì)胞是趨于凋亡的，能夠釋放HMGB1。接下來的研究將著重闡明在白癜風(fēng)中HMGB1如 何 通 過 HMGB1－TLR 或 者 HMGB1－RAGE通路發(fā)揮作用。

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