子癇前期和正常妊娠患者血清及胎盤組織中sFlt－1的表達研究

西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科（西安710003） 俞春芝 趙現(xiàn)立

子癇前期是妊娠期特有的疾病，可伴全身多器官功能損害或功能衰竭，嚴(yán)重者出現(xiàn)抽搐，昏迷甚至死亡。子癇前期的病因至今尚未完全闡明，其發(fā)病可能與胎盤滋養(yǎng)細胞缺血，血管內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)有關(guān)［1］。可溶性血管內(nèi)皮細胞生長因子受體－1（sFlt－1）在參與滋養(yǎng)細胞浸潤以及血管生成及調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，本研究通過檢測子癇前期和正常妊娠患者血清sFlt－1的濃度變化，胎盤組織中sFlt－1蛋白和mRNA的表達水平，探究sFlt－1的表達與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。

資料與方法

1 一般資料 選擇我院2013年至2014年2月住院病例共60例，子癇前期組40例（其中輕度子癇前期20例，重度子癇前期20例），平均年齡28±3歲，平均孕周36±4周，子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類參照文獻［2］。同期住院的正常妊娠者20例為對照組，平均年齡27±2歲，平均孕周38±4周。兩組孕婦均為初產(chǎn)婦，單胎妊娠，排除內(nèi)科合并癥和其他產(chǎn)科并發(fā)癥，分娩方式以剖宮產(chǎn)終止妊娠。

2 方 法 ①標(biāo)本采集：臨產(chǎn)前，無胎膜早破，子癇前期組在接受藥物治療之前空腹抽取肘靜脈血3ml，室溫放置30min，自凝后離心分離血清，置－20℃冰箱保存待檢。各組患者剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后20min內(nèi)取胎盤中央約2cm×2cm×2cm大小的兩塊組織，標(biāo)本均分為兩份，l份置10%福爾馬林溶液固定24h備用，另1份放于無菌Eppendorff管，15min內(nèi)置于液氮中保存，以待RNA提取。②血清sFLt－1測定：采用ELISA法檢測血清sFLt－1水平。用奧地利Bender公司ELISA試劑盒，用校正稀釋液代替血清標(biāo)本作為陰性對照。③胎盤組織中sFlt－1蛋白的表達：常規(guī)組織脫水和石蠟包埋制成3μm厚的連續(xù)切片，經(jīng)HE染色后，采用SP法。免疫組化操作步驟按PV6000免疫組化試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）說明書進行。PBS代替一抗作為陰性對照。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本組織細胞質(zhì)或基質(zhì)中有黃色和（或）棕黃色顆粒。④RT－PCR技術(shù)檢測sFlt－1mRNA表達水平：總RNA提?。喊碩rizol說明書提取總RNA；引物合成：根據(jù)已知基因序列設(shè)計引物，sFlt－1基因為525bp，GAPDH 基因為226bp；RT－PCR半定量分析：根據(jù)Promega公司試劑盒，將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴增sFlt－1基因及內(nèi)參照基因GADPH。sFlt－1 擴增條件為 94℃ 45s、65℃ 45s、72℃45s，24個循環(huán)。GADPH擴增條件為94℃45s、52℃45s、72℃45s，21個循環(huán)。2% 瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)果用計算機掃描分析，以各標(biāo)本sFlt－1和GADPH擴增條帶的實際灰度值的比值表示sFlt－1mRNA的表達水平。

3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以±s表示，t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組孕婦血清sFlt－1水平比較 見表1。輕度及重度子癇前期患者血清中sFlt－1水平顯著高于正常妊娠組（P均＜0．05）。輕度及重度子癇前期患者兩組之間血清中sFlt－1水平差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

2 各組孕婦胎盤組織中sFlt－1蛋白表達比較見表2。輕度及重度子癇前期患者胎盤組織中sFlt－1蛋白表達強度明顯高于對照組（P＜0．05）。重度子癇前期患者胎盤組織中sFlt－1蛋白表達高于輕度組 （P＜0．05）。

表1 各組血清sFlt－1測定結(jié)果（±s，μg／L）

表1 各組血清sFlt－1測定結(jié)果（±s，μg／L）

注：與對照組比較 ＊P＜0．05，與輕度組比較△P＜0．05

組 別 n 20 7．53±2．51輕度子癇前期組 20 23．51±3．12＊重度子癇前期組 20 35．68±4．16 sFlt－1對照組＊△

表2 各組孕婦胎盤組織中sFlt－1蛋白表達的比較（±s）

表2 各組孕婦胎盤組織中sFlt－1蛋白表達的比較（±s）

注：與對照組比較 ＊P＜0．05，與輕度組比較△P＜0．05

組 別 n 陽性細胞率（%） 光密度OD值20 21．61±2．51 36．72±3．18輕度子癇前期組 20 51．24±3．18＊ 79．31±2．71＊重度子癇前期組 20 55．48±4．37＊△ 82．24±3．52對照組＊△

3 各組孕婦胎盤組織sFlt－1mRNA表達的比較見表3。輕度及重度子癇前期患者sFlt－1mRNA平均灰度比值則顯著高于對照組（P＜0．05）。重度子癇前期患者血清中sFlt－1mRNA表達高于輕度組（P＜0．05）。

表3 各組孕婦胎盤組織sFlt－1mRNA相對表達量的比較（±s）

表3 各組孕婦胎盤組織sFlt－1mRNA相對表達量的比較（±s）

注：與對照組比較 ＊P＜0．05，與輕度組比較△P＜0．05

組 別 n 20 0．15±0．03輕度子癇前期組 20 0．78±0．02＊重度子癇前期組 20 0．86±0．04 sFlt－1mRNA對照組＊△

討 論

妊娠期高血壓疾病的病因和發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)病可能與胎盤滋養(yǎng)細胞缺血，血管內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)有關(guān)。近來，胎盤淺著床理論逐漸為多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可［3］。正常妊娠時，子宮螺旋小動脈管壁平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞凋亡，代之以絨毛外滋養(yǎng)細胞，且深達子宮壁的淺肌層。充分的螺旋小動脈重鑄使血管管徑擴大，形成子宮胎盤低阻力循環(huán)以滿足胎兒生長發(fā)育的需要。但妊娠期高血壓患者的滋養(yǎng)細胞浸潤過淺，只有蛻膜層血管重鑄，俗稱“胎盤淺著床”。螺旋小動脈重鑄不足使胎盤血流量減少，胎盤的缺血，缺氧可使胎盤釋放因子，引起子癇前期一系列表現(xiàn)［4－5］。

可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sVEGFR－1或sFlt－1）是血管內(nèi)皮生長的因子（VEGF）的可溶性受體，主要是由胎盤產(chǎn)生，具有可分泌性，組織中自然分泌產(chǎn)物較少，屬于稀有剪接形式［3－4］。sFlt－1能與內(nèi)皮細胞表面受體kDR和Flt1形成異源二聚體，最終阻斷血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胎盤生長因子（PIGF）的生物學(xué)效應(yīng)，造成全身內(nèi)皮功能失調(diào)，產(chǎn)生高血壓，蛋白尿等臨床表現(xiàn)［6］。

本研究通過檢測子癇前期患者血清中sFlt－1水平和胎盤組織中sFlt－1mRNA的表達水平，了解sFlt－1的表達與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性和預(yù)期相關(guān)性。sFlt－1檢測可用于臨床對子癇前期的早期診斷中，期望成為早期篩查子癇前期的指標(biāo)，給予抑制sFlt－1活性的藥物將更有效的改善其癥狀，提高孕產(chǎn)婦及新生兒的預(yù)后質(zhì)量。

［1］ Pijnenborg R，Vercruysse L，Verbist L，et al．Interaction of interstitial trophoblast with placental bed capillaries and venules of normotensive and pre－eclamptic pregnancies［J］．Placenta，1998，19：569－575．

［2］ 樂 杰．婦產(chǎn)科學(xué)［M］．7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：99－101．

［3］ Maynard SE，Moore TA，Bur L，et al．Soluble endoglin for the prediction of preeclampsia in a high risk cohort［J］．Hypertens Pregnancy，2010（3）：330．

［4］ Foidart JM，Schaaps JP，Chantraine F，et al．Dysregulation of anti－angiogenic agents （sFlt－1，PLGF，and sEndoglin in preeclampsiaa step forward but not the definitive answer［J］．J Reprod Immunol，2009，82（2）：106－111 ．

［5］ Makris A，Thornton C，Thompson J，et al．Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated Sflt－1［J］．Kidney Int，2007，71（10）：977－984．

［6］ 陶婭玲，漆洪波．子癇前期孕婦血清及尿液中 VEGF、PLGF、sFlt－1水平變化及意義［J］．實用婦產(chǎn)科雜志，2008，24（8）：496－498．