靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍預(yù)防糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變及對(duì)VEGF表達(dá)的影響

喬 進(jìn)，竇志華，吳 鋒，孟國(guó)梁，陳 惠，鄭惠華

(南通市第三人民醫(yī)院1.藥劑科、2.藥理學(xué)系，江蘇 南通 226001;3.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226006)

糖尿病血管病變是糖尿病(diabetes mellitus，DM)慢性并發(fā)癥之一，其患病、發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人體健康，影響人們的生活質(zhì)量，是糖尿病患者致殘及死亡的首要原因。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn):首次篩查并發(fā)癥的糖尿病人群中，一項(xiàng)及以上大血管病變患病率達(dá) 38.3%［1］。靈芝多糖(ganoderma lucidum poly- saccharide，GLPs)為真菌靈芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷鍵為主鏈的多糖［2］。二甲雙胍(metformin)為臨床常用降糖藥之一，具有明顯降糖和改善胰島素抵抗的作用，近年來(lái)研究證實(shí)了其具有一定的防治糖尿病血管并發(fā)癥和保護(hù)心血管的作用［3］。吳鋒等［4］研究發(fā)現(xiàn)，GLPs能抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。筆者［5］證實(shí)GLPs可有效抑制血清糖基化終末產(chǎn)物及增強(qiáng)體內(nèi)CAT、GSH-Px活性來(lái)保護(hù)主動(dòng)脈內(nèi)皮功能。聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥物治療糖尿病心血管疾病具有理論上的優(yōu)點(diǎn)，即在降低血糖的同時(shí)抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。但兩藥聯(lián)合應(yīng)用其療效是否優(yōu)于單用，尚未見報(bào)道。本研究建立2型糖尿病大鼠模型，觀察GLPs聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈病變的抑制作用，探討其可能作用機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠80只，♂♀各半，體質(zhì)量160～180 g，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):FYXK(蘇)2007－0021。

1.2 藥品與儀器 靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司，批號(hào):100601)，純度:75.61%，以0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)配置成溶液;二甲雙胍(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào):67100507);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，臨用前用0.1 mol·L－1檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液;過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品);第2代免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);兔抗VEGF多抗(武漢博士德生物工程有限公司);小鼠抗β-actin多克隆抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG(上?？党缮锕こ逃邢薰?;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(海門碧云天生物研究所)。One Touch血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司);日立7170A全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司);BH-NIC-B型倒置顯微鏡(日本O-lympus公司);蛋白電泳儀(美國(guó) Bio-Rad公司);SH-100型凝膠圖像分析儀(上海復(fù)旦四星高科技技術(shù)公司)。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 SD大鼠80只，分為正常對(duì)照組和造模組。正常對(duì)照組10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組70只給予高脂飲食(基礎(chǔ)飼料70%、脂肪20%、蛋黃粉5%、奶粉5%)，喂養(yǎng)4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg－1腹腔注射。1 周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1即造模成功，繼續(xù)高脂飲食。取40只成模大鼠隨機(jī)分為4組:糖尿病組、靈芝多糖組(靈芝多糖600 mg·kg－1)、二甲雙胍組(二甲雙胍600 mg·kg－1)、聯(lián)合用藥組(靈芝多糖300 mg·kg－1+二甲雙胍 300 mg·kg－1)。每日上午11∶00時(shí)灌胃給藥，qd，正常對(duì)照組和糖尿病組予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖測(cè)定 12周末，禁食14～16 h，大鼠尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。

1.4.2 血清CAT、GSH-Px含量測(cè)定 用CAT分解H2O2，再加入鉬酸銨的方法測(cè)CAT活力，用酶促反應(yīng)的速度表示GSH-Px的活力，具體操作法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4.3 血清 TC、TG 水平測(cè)定 取血，2 000 r·min－1分離血清，日立7170A全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG含量。

1.4.4 病理組織學(xué)觀察 取胸主動(dòng)脈用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，常規(guī)HE染色，光鏡觀察胸主動(dòng)脈病理組織學(xué)變化。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈VEGF的表達(dá) 取部分胸主動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)石蠟包埋，切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胸主動(dòng)脈中VEGF的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。各抗體按1∶50的方法稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，將切片置于高倍鏡下(×200)，每張切片隨機(jī)選取8～10個(gè)視野，細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性信號(hào)。采用JEDA801D型形態(tài)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)所占面積及平均灰度，二者乘積(即積分光密度值)越大表明組織中該抗原含量越高。

1.4.6 免疫印跡檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá) 取100 mg胸主動(dòng)脈，置入組織裂解液(含有蛋白酶抑制劑)提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V;300 mA轉(zhuǎn)膜150 min至PVDF膜上;含有5%脫脂奶粉PBST室溫封閉1 h，分別加入VEGF和β-actin抗體4℃過夜，再加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)1 h，洗膜后暗室加ECL，X線膠片曝光后顯影、定影。用四星圖像處理系統(tǒng)測(cè)定各組目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參(β-actin)表達(dá)量的比值，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Stata10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析，q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖 糖尿病組空腹血糖水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.01)。用藥組空腹血糖水平均低于糖尿病組(P＜0.01)，其中聯(lián)合用藥組下降幅度最大。見Tab 1。

Tab 1 Blood glucose in rats of each group(±s，n=10)

Tab 1 Blood glucose in rats of each group(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs DM

Group Blood glucose/mmol·L －1 CON 3.51 ±0.25##DM 19.13 ±0.81＊＊GLPs 11.16 ±0.33＊＊##Met 13.77 ±0.57＊＊##COM 7.35 ±0.64*##

2.2 大鼠血清CAT、GSH-Px含量測(cè)定 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血清CAT、GSH-Px活性降低(P＜0.01)，用藥組大鼠血清 CAT、GSH-Px活性有不同程度的升高(P＜0.05)，其中聯(lián)合用藥組升高最為明顯(P＜0.01)，效果強(qiáng)于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。見 Tab 2。

Tab 2 CAT and GSH-Px levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

Tab 2 CAT and GSH-Px levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group CAT/kU·g－1 GSH-Px/kU·g －1 CON 14.21 ±2.15 2598.13 ±126.75 DM 4.24 ±0.51＊＊ 1321.12 ±108.17＊＊GLPs 8.12 ±1.23# 1759.52 ±152.16#Met 7.15 ±1.47# 1680.43 ±135.15#COM 12.19 ±1.18##△ 2212.43 ±178.41##△

2.3 大鼠血清TC、TG水平測(cè)定 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組血清TC、TG水平明顯升高(P＜0.01)，與糖尿病組相比，各治療組血清TC、TG水平明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。見Tab 3。

2.4 胸主動(dòng)脈病理學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束取大鼠胸主動(dòng)脈橫斷面切片行病理學(xué)檢查，HE染色可見，正常對(duì)照組:血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清晰，表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，無(wú)脫落;糖尿病組:內(nèi)膜明顯增厚，表面不光滑，內(nèi)皮細(xì)胞突起，形態(tài)不規(guī)則，中膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂;靈芝多糖組:內(nèi)膜略微增厚，表面不光滑，中膜輕度增厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂;二甲雙胍組:形態(tài)比糖尿病組略微好轉(zhuǎn)，中膜未見明顯增厚;聯(lián)合用藥組:內(nèi)膜較光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列較整齊，脂質(zhì)沉積較模型組少，中膜未見明顯增厚，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，程度較糖尿病組明顯減輕。見Fig 1。

Tab 3 TC and TG levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

Tab 3 TC and TG levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊ P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Met or GLPs

Group TC/mmol·L －1 TG/mmol·L －1 CON 1.58 ±0.21 0.46 ±0.09 DM 7.54 ±0.35＊＊ 2.51 ±0.23＊＊GLPs 4.98 ±0.39# 1.59 ±0.11#Met 5.23 ±0.41# 1.61 ±0.15#COM 2.17 ±0.16##△△ 0.78 ±0.14##△

2.5 免疫組化檢測(cè)胸主動(dòng)脈VEGF的表達(dá) 棕褐色為目標(biāo)蛋白表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠主動(dòng)脈VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。與糖尿病組相比，3個(gè)治療組VEGF的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，其中聯(lián)合用藥組蛋白表達(dá)最低(P＜0.01)，低于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。見Fig 2、Tab 4。

2.6 蛋白印記檢測(cè)胸主動(dòng)脈VEGF的表達(dá) 內(nèi)參β-actin在各組中有均一表達(dá)，VEGF在各組中的蛋白條帶深淺不一，見Fig 3。

Fig 3 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group

Tab 4 Expression of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

Tab 4 Expression of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.35 ±0.11 DM 3.24 ±0.24＊＊GLPs 2.09 ±0.17#Met 2.16 ±0.15#COM 0.71 ±0.08##△

用四星圖像處理系統(tǒng)測(cè)出各組蛋白表達(dá)與βactin的表達(dá)量，計(jì)算出比值。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠主動(dòng)脈VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。與糖尿病組相比，3個(gè)治療組的蛋白表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組組下調(diào)最為明顯(P＜0.01)。見Tab 5。

3 討論

本研究通過高脂飲食配合注射小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病模型，聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖與二甲雙胍干預(yù)，結(jié)果提示糖尿病組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血糖維持高水平，聯(lián)合用藥組血糖明顯低于模型組(P＜0.01)，并明顯低于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。

Tab 5 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

Tab 5 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.25 ±0.01 DM 0.99 ±0.02＊＊GLPs 0.73 ±0.01#Met 0.76 ±0.02#COM 0.47 ±0.02##△

糖尿病血管病變是糖尿病常見的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一。研究表明，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在糖尿病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［6］。干預(yù)氧化應(yīng)激既可以消除病因，如恢復(fù)血糖、血脂水平;也可從病理環(huán)節(jié)著手，如切斷氧化應(yīng)激發(fā)生、消除氧化應(yīng)激產(chǎn)物等。在體內(nèi)高糖環(huán)境下，機(jī)體一方面清除氧自由基酶(CAT、GSH-Px)的活性降低，另一方面體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成了大量氧自由基在體內(nèi)積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)一系列糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［7］。同時(shí)，氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展與血清中TC、TG水平有關(guān)［8］。本研究中，糖尿病組大鼠胸血清TC、TG含量明顯升高(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組血清 TC、TG含量明顯降低(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)，提示在藥物總的劑量不變的前提下，靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)合使用能減少TC、TG含量，即降低血脂水平，增強(qiáng)清除氧自由基酶的活性，抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激的形成，較單獨(dú)用藥更好的增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等致炎因子參與介導(dǎo)糖尿病的發(fā)生和炎癥損傷［9］。因此，抑制致炎因子及其相關(guān)信號(hào)通路是防治糖尿病血管病變的重要策略之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管內(nèi)外物質(zhì)交換和血管新生，具有重要生理作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷常常是糖尿病血管并發(fā)癥和高血壓等疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，并貫穿疾病整個(gè)過程［10］。因此，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)已成為治療糖尿病大血管病變研究的重要方向。作為血管新生相關(guān)因子，VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂原和趨化因子，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速新生血管的形成［11］。張力等［12］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與糖尿病的血管病變密切相關(guān)。VEGF屬血小板源性生長(zhǎng)因子家族，其受體僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生，提高單層內(nèi)皮的通透性［13］，血清VEGF水平上升、血管通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與糖尿病進(jìn)程密切相關(guān)［14－15］。給藥12周末，光鏡下觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，同等劑量的靈芝多糖于二甲雙胍對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜的保護(hù)作用相當(dāng)，總藥物劑量不變情況下，兩種藥物聯(lián)合使用能增強(qiáng)對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜的保護(hù)作用，結(jié)果優(yōu)于單獨(dú)用藥。

VEGF的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在:(1)促進(jìn)血管通透性;(2)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，使血管生成;(3)刺激人的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)，并使其濃度呈劑量依賴性增加，起到維持血管作用;(4)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加快血管內(nèi)皮愈合。有研究表明:血清VEGF與血管并發(fā)癥密切相關(guān)［16］。在對(duì)VEGF與大血管病變關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，合并有糖尿病大血管病變的患者，血清VEGF較對(duì)照組明顯升高。動(dòng)脈粥樣斑塊形成時(shí)，激發(fā)了血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞等，產(chǎn)生大量的VEGF，同時(shí)由于動(dòng)脈粥樣硬化組織存在著局部缺血，而缺血、缺氧是誘發(fā)多種組織細(xì)胞分泌VEGF增加的重要原因［17］。Sun 等［18］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺氧應(yīng)激可能造成細(xì)胞功能受損，部分細(xì)胞的功能代償使VEGF表達(dá)上調(diào)，VEGF水平升高更進(jìn)一步加重脂肪細(xì)胞功能障礙的二元受損。T2DM空腹VEGF水平上調(diào)，增加機(jī)體腎臟、視網(wǎng)膜等血管性病變的發(fā)生。Elshal等［19］研究表明鏈脲佐菌素建模T2DM大鼠血管通透性高，VEGF水平上升。本研究中，糖尿病大鼠血管病變的同時(shí)伴隨VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)，證實(shí)VEGF過度表達(dá)是導(dǎo)致糖尿病血管病的因素之一。聯(lián)合用藥治療后，大鼠主動(dòng)脈VEGF的表達(dá)明顯下降(P＜0.01)?？偹幬飫┝坎蛔兦闆r下，聯(lián)合用藥對(duì)大鼠主動(dòng)脈VEGF表達(dá)的抑制作用要強(qiáng)于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。

綜上所述，在2型糖尿病大鼠模型中，聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖和二甲雙胍在降血糖和改善主動(dòng)脈病變程度效果優(yōu)于單藥使用，其機(jī)制可能與降低血脂水平、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、下調(diào)主動(dòng)脈病變過程中VEGF的表達(dá)有關(guān)。聯(lián)合這兩種藥物對(duì)臨床治療糖尿病有一定的指導(dǎo)意義。有關(guān)VEGF的表達(dá)是否為糖尿病血管病變的決定因素，聯(lián)合用藥在臨床上的適宜劑量、可能產(chǎn)生的副作用在今后將做進(jìn)一步研究。

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