4－苯基丁酸對(duì)糖尿病大鼠的心臟保護(hù)作用

何玉蓮，熊 燕，張 梅

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1.蛇毒研究所、2.藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510082)

糖尿病患者易并發(fā)心血管疾病，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是患者的主要致死原因之一。DCM是由糖尿病引起的獨(dú)立于高血壓和冠心病，且不能用其他危險(xiǎn)因子解釋的特殊心臟疾病，主要表現(xiàn)為心臟舒張和收縮功能障礙以及心臟微細(xì)結(jié)構(gòu)的改變，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭［1］。目前，降血糖仍是DCM治療的基礎(chǔ)，調(diào)血脂藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑和β受體阻滯劑等仍作為目前治療DCM的主要藥物，均能夠在糖尿病人中發(fā)揮一定程度的心肌保護(hù)作用并延緩DCM進(jìn)展。最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)的糖尿病人數(shù)已達(dá)到9 200萬(wàn)，糖尿病前期患者高達(dá)1.4億［2］。因此，面對(duì)逐年增長(zhǎng)的糖尿病發(fā)病率，尋找新的治療藥物及靶點(diǎn)已成為醫(yī)學(xué)研究的緊迫任務(wù)。

4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)是美國(guó)FDA在1996年批準(zhǔn)上市的新藥，最早作為特殊的氨類清除劑用于治療慢性尿素循環(huán)紊亂［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，4-PBA可恢復(fù)肥胖所致2型糖尿病動(dòng)物的血糖水平，改善胰島素敏感性，降低糖尿病小鼠肝臟脂質(zhì)沉積等作用［4］。此外，文獻(xiàn)報(bào)道4-PBA可對(duì)抗阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷［5］。故本研究擬利用建立的1型糖尿病大鼠模型，觀察4-PBA對(duì)糖尿病動(dòng)物心功能的保護(hù)效應(yīng)，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ♂Sprague-Dawley(SD)大鼠為SPF級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK粵2008－0002)。

1.2 藥品與試劑 4-PBA購(gòu)自上海Adamas-beta公司，鏈脲佐菌素為Sigma公司產(chǎn)品，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 儀器設(shè)備 血糖檢測(cè)儀(強(qiáng)生公司)，PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(Labchart7，AD instruments，Australia)，PowerLab八道電生理記錄儀(AD instruments，Australia)，多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Epoch，Biotek，USA)，紫外分光光度計(jì)(Smart SpecTMplus，Bio-rad，America)。

2 方法

2.1 1型糖尿病大鼠模型制備及飼養(yǎng) SD大鼠飼養(yǎng)在自由飲水和進(jìn)食(12 h開(kāi)燈和12 h閉燈)的環(huán)境，室溫和相對(duì)濕度分別維持在(22±2)℃和(45±5)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組:對(duì)照組、糖尿病組、糖尿病+4-PBA治療組。大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg·kg－1，溶于pH 4.5的0.1 mol·L－1檸檬酸鹽緩沖液)，72 h后測(cè)空腹血糖，凡連續(xù)兩次測(cè)得隔日隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L－1，即可認(rèn)為糖尿病建模成功。第5周開(kāi)始每天給予糖尿病大鼠4-PBA(1 g·kg－1)灌胃，對(duì)照各組動(dòng)物分別給予相應(yīng)的溶媒灌胃，連續(xù)治療20周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠大動(dòng)脈和左心室血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 異氟烷吸入全身麻醉后，大鼠仰臥固定，頸部皮膚去毛，PE50導(dǎo)管注滿0.1%肝素，與PowerLab系統(tǒng)相連，橋式放大器調(diào)零。經(jīng)右頸總動(dòng)脈切口插入PE50導(dǎo)管，深入1.5 cm左右停留3 min以記錄大動(dòng)脈內(nèi)血流和壓力變化，繼續(xù)插入，同時(shí)觀察屏幕上的波形，當(dāng)波幅明顯增大且導(dǎo)管劇烈抖動(dòng)時(shí)，表明導(dǎo)管已進(jìn)入左心室。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由PowerLab八道電生理記錄儀自動(dòng)采集，實(shí)驗(yàn)完成后經(jīng)PowerLab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)獲得大動(dòng)脈和左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2.3 大鼠血清及心臟組織生化指標(biāo)測(cè)定 完成血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后收集大鼠血液和心臟樣本。血液凝固后3 000 r·min－1離心10 min獲取血清樣本。心肌組織冰浴下勻漿，3 000 r·min－1離心10 min取上清液作為樣本。采用羥胺法測(cè)定血清及心臟組織中SOD活力;硫代巴比妥酸法測(cè)定血清及心臟組織中MDA含量;化學(xué)比色法測(cè)定血清及心臟組織中NOS活力;硝酸還原酶法測(cè)定心臟組織中NO含量。測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 14.0進(jìn)行分析，用±s表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，用最小有意義差異檢驗(yàn)(least significant difference，LSD和SNK)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

3 結(jié)果

3.1 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠血糖、體重、心臟重量和心指數(shù)的影響 Tab 1數(shù)據(jù)顯示，糖尿病大鼠血糖明顯升高、體重明顯減輕和心指數(shù)增加(P＜0.05)，但4-PBA治療對(duì)糖尿病大鼠血糖、體重和心指數(shù)均無(wú)明顯影響(P＞0.05)。

3.2 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠大動(dòng)脈和心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響

3.2.1 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠大動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)的影響 Tab 2數(shù)據(jù)顯示，糖尿病大鼠的大動(dòng)脈收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓較正常大鼠相比均明顯降低(P＜0.05)，4-PBA治療可輕度升高糖尿病大鼠大動(dòng)脈收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓(P＞0.05)。

Tab 1 Effect of 4-PBA on blood glucose，body weight，heart weight and heart index(±s，n=5)

Tab 1 Effect of 4-PBA on blood glucose，body weight，heart weight and heart index(±s，n=5)

Blood glucose was measured by colorimetry.4-PBA，which was administrated at fifth week after diabetic model were established，was used to treat diabetic rats for 20 weeks by P.O.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Control T1DM 4-PBA+T1DM Blood glucose/mmol·L －1 5.38±1.58 29±5.30＊＊2.72 ±0.22 25.84 ±6.11 Heart weight/mg 1196.64 ±166.72 911.33 ±123.82* 927.26 ±90.00 The body weight/g 570.8±93.30 339.50 ±52.98＊＊ 343.60±47.31 Index of heart weight/mg·g－1 2.10±0.12 2.69±0.13＊＊

Tab 2 Effect of 4-PBA on hemodynamics of main artery in diabetic rats(±s，n=5)

Tab 2 Effect of 4-PBA on hemodynamics of main artery in diabetic rats(±s，n=5)

Hemodynamic parameters of main artery were measured by the PowerLab system.Diabetic rats were given the same treatment as before.*P ＜0.05 vs control.

Control T1DM 4-PBA+T1DM Systolic pressure/kPa 17.16 ±1.16 12.52 ±1.81*11.17 ±0.79 13.1 ±0.95 Diastolic pressure/kPa 13.45 ±1.47 9.44 ±2.06* 9.90 ±0.70 Mean pressure/kPa 15.22 ±1.24 10.86 ±2.08* 11.50 ±0.84 Mean diastolic pressure/kPa 14.28 ±1.38 10.55 ±2.26*

3.2.2 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響 Tab 3數(shù)據(jù)顯示，與正常大鼠相比糖尿病大鼠的心率、左心室收縮壓、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dt)降低，而左心室舒張壓升高，左心室收縮和舒張時(shí)程、循環(huán)時(shí)間和左心室弛緩時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.01)。4-PBA治療可輕度改善糖尿病大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)(P＞0.05)，但明顯縮短左心室弛緩時(shí)間(P＜0.05)。

3.3 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠血清和心肌組織生化功能的影響

3.3.1 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠血清和心肌組織SOD和MDA的影響 與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌組織SOD活力明顯降低，并且MDA含量明顯增加，4-PBA治療能夠明顯升高糖尿病大鼠心肌組織SOD活力，降低MDA含量(Fig 1A、1C)。與之一致的是，糖尿病大鼠血清中SOD活力也明顯降低，MDA含量明顯增加，4-PBA治療明顯改善血清這一生化改變(Fig 1B、1D)。

3.3.2 4-PBA對(duì)糖尿病大鼠血清和心肌組織NOS和NO的影響 與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌組織NOS活力和NO含量明顯降低，4-PBA治療能夠明顯升高糖尿病大鼠心肌組織NOS活力和NO含量(Fig 2A、2C)。與正常大鼠相比，糖尿病大鼠血清NOS活力無(wú)明顯變化，但血清NO含量明顯下降(Fig 2B、2D)，4-PBA治療可明顯升高糖尿病大鼠血清NO含量。

Fig 1Effect of 4-PBA on the activity of SOD and the level of MDA in the heart and serum of diabetic rats(±s，n=5)

Tab 3 Effect of 4-PBA on hemodynamics of left ventricular in diabetic rats(±s，n=5)

Tab 3 Effect of 4-PBA on hemodynamics of left ventricular in diabetic rats(±s，n=5)

Hemodynamic parameters of left ventricular were measured by the PowerLab system.Diabetic rats were given the same treatment as before.Max pressure:systolic pressure of left ventricular;Min pressure:diastolic pressure of left ventricular;EDP:end-diastolic pressure of left ventricular;Mean pressure:mean pressure of left ventricular;Max dp/dt:maximum left ventricular pressure increase rate;Min dp/dt:minimum left ventricular pressure decrease rate;IRP Average dp/dt:period of isovolumic relaxation average dp/dt;Tau:left ventricular relaxation time constant.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs T1DM group.

Control T1DM T1DM+4-PBA Heart rate/BPM 472.22±47.88 330.79±40.25＊＊355.17±34.32 Max pressure/kPa 18.53±0.48 12.55±0.91＊＊ 13.52±1.52 Min pressure/kPa 0.09±0.01 1.16±0.58＊＊ 1.07 ±0.48 Mean pressure/kPa 9.88±0.20 7.36±0.98＊＊ 7.97 ±0.91 EDP/kPa 3.30±0.56 3.18±0.40 3.32 ±0.41 Systolic duration/s 0.079±0.007 0.11±0.014＊＊ 0.11±0.012 Diastolic duration/s 0.049±0.0050 0.073 ±0.011＊＊ 0.064±0.0069 Cycle duration/s 0.128±0.012 0.18±0.025* 0.17±0.017 Max dp/dt/kPa·s－1 1452.17±56.49 1188.66±21.93＊＊ 1245.02±81.11 Min dp/dt/kPa·s－1 －1390.01±42.57 －1147.48±23.85＊＊ －1189.76±48.76 IRP Average dp/dt/kPa·s－1 －492.64±58.57 －221.75±26.36＊＊ －281.18±44.37 Tau/s 0.40±0.70 2.15±1.96＊＊ 1.42±1.57#

4 討論

Rubler在1972年觀察到一些成年糖尿病患者在無(wú)明顯冠狀動(dòng)脈和心瓣膜病變以及高血壓等心血管危險(xiǎn)因素存在的情況下，罹患充血性心力衰竭，認(rèn)為這是一類特異性繼發(fā)于糖尿病的心肌病變，從而首次提出DCM的概念。進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查、臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均顯示糖尿病人確實(shí)存在特異性心肌病變。DCM的形成是一個(gè)慢性復(fù)雜的過(guò)程，糖尿病動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在誘發(fā)糖尿病14周后方可出現(xiàn)較穩(wěn)定的心功能紊亂表現(xiàn)［6］。本研究使用STZ誘導(dǎo)并建立大鼠1型糖尿病模型，血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，建模后24周的糖尿病大鼠大動(dòng)脈收縮壓和舒張壓、心率、左心室收縮壓、±dp/dt均明顯降低，而左心室舒張壓明顯升高，左心室收縮和舒張時(shí)程、循環(huán)時(shí)間和左心室弛緩時(shí)間明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明病程半年左右的糖尿病大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯心臟收縮和舒張功能障礙。4-PBA治療20周可改善糖尿病大鼠的各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，尤其是可明顯縮短糖尿病大鼠左心室弛緩時(shí)間，表明4-PBA能夠減輕糖尿病大鼠心臟舒張功能障礙。

Fig 2Effect of 4-PBA on the activity of NOS and the level of NO in the heart and serum of diabetic rats(±s，n=5)

糖尿病人體內(nèi)氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，并且參與了其心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示糖尿病大鼠血清和心肌組織的SOD活力明顯降低，MDA含量明顯增加，也再次證明糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而4-PBA治療可明顯升高糖尿病大鼠血清和心肌組織SOD活力，降低MDA含量，表現(xiàn)出良好的抗氧化作用，說(shuō)明4-PBA可減輕糖尿病動(dòng)物體內(nèi)的氧化損傷。糖尿病時(shí)高血糖是氧化應(yīng)激的重要誘發(fā)因素，研究報(bào)道4-PBA可降低2型糖尿病動(dòng)物的血糖水平［4］。但本研究顯示，4-PBA對(duì)1型糖尿病大鼠血糖水平和體重均沒(méi)有影響，提示其抗氧化作用可能通過(guò)其他機(jī)制，而與大鼠血糖水平無(wú)關(guān)。一氧化氮作為心血管系統(tǒng)重要的內(nèi)源性保護(hù)因子，具有抑制血小板聚集和血管平滑肌增生，調(diào)節(jié)血管張力和清除氧自由基等作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，糖尿病大鼠心肌組織NOS活力和NO含量明顯降低，4-PBA治療能夠明顯升高糖尿病大鼠心肌組織NOS活力和NO含量，這一結(jié)果提示4-PBA的心臟保護(hù)作用可能與其促進(jìn)心肌NO生成有關(guān)。

4-PBA是一種短鏈脂肪酸，具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(作為分子伴侶)和抑制去乙?；傅淖饔?，近年來(lái)廣泛用于糖尿病以及代謝性疾病的研究［4，7－9］。4-PBA可降低自發(fā)性2型糖尿病大鼠左心室舒張末壓，改善糖尿病大鼠心臟舒張功能，這一作用與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［7］。在1型糖尿病大鼠腎病研究發(fā)現(xiàn)，4-PBA通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和減輕氧化損傷抑制糖尿病腎病的進(jìn)程［8］。此外，4-PBA尚對(duì)非酒精性脂肪肝具有良好的保護(hù)作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)4-PBA可以改善1型糖尿病大鼠的心臟血流動(dòng)力學(xué)，緩解心臟舒張功能障礙，這一作用可能與其抑制糖尿病動(dòng)物體內(nèi)氧化應(yīng)激和促進(jìn)心肌NO生成有關(guān)。綜上所述，4-PBA作為一個(gè)多靶點(diǎn)藥物，其對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥和代謝性疾病的防治表現(xiàn)出較好的療效，而本研究也證明了4-PBA可以改善1型糖尿病大鼠的心功能，具有防治糖尿病心臟并發(fā)癥的潛能，但有關(guān)4-PBA抗氧化作用和心臟保護(hù)機(jī)制尚需在以后的研究中深入探討。

［1］Boudina S，Abel E D.Diabetic cardiomyopathy revisited［J］.Circulation，2007，115(25):3213－23.

［2］Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090－101.

［3］Maestri N E，Brusilow S W，Clissold D B，et al.Long-term treatment of girls with ornithine transcarbamylase deficiency［J］.N Engl J Med，1996，335(12):855－9.

［4］Ozcan U，Yilmaz E，Ozcan L，et al.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes［J］.Science，2006，313(5790):1137 －40.

［5］Daosukho C，Chen Y，Noel T，et al.Phenylbutyrate，a histone deacetylase inhibitor，protects against adriamycin-induced cardiac injury［J］.Free Radic Biol Med，2007，42(12):1818 －25.

［6］Li Y，Gu Y，Song Y，et al.Cardiac functional analysis by electrocardiography，echocardiography and in situ hemodynamics in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.J Health Sci，2004，50(4):356－65.

［7］Takada A，Miki T，Kuno A，et al.Role of ER stress in ventricular contractile dysfunction in type 2 diabetes［J］.PLoS One，2012，7(6):e39893.

［8］Luo Z F，F(xiàn)eng B，Mu J，et al.Effects of 4-phenylbutyric acid on the process and development of diabetic nephropathy induced in rats by streptozotocin:regulation of endoplasmic reticulum stressoxidative activation［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2010，246(1 －2):49－57.

［9］陳 熙，張 程，趙 卉，等.4-苯基丁酸對(duì)果糖所致非酒精性脂肪肝的保護(hù)效應(yīng)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):661－5.

［9］Chen X，Zhang C，Zhao H，et al.The protective effect of 4-phenyl butyric acid on fructose-evoked nonalcoholic fatty liver disease in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):661 －5.