5－氨基乙酰丙酸輔助二甲雙胍的降血糖作用

姜華鳳，曹水江，沈 峰，侯 杰，湯 雷，范思祥，仲婷婷，張象威，曹 莉

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇蘇州 215123;2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院南京分院普外科，江蘇南京 210015)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是四氫吡咯的前綴化合物，是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素 B12等必不可少的物質(zhì)［1］。以往5-ALA作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛［2－4］。醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域則大多將5-ALA作為一種新型光動(dòng)力藥物，用于美容及局部或全身的皮膚疾病的治療［5－6］。近年來(lái)，有臨床研究報(bào)道，5-ALA 可延緩糖尿病前期病程的發(fā)展，改善糖尿病前期病人的糖耐量［7－8］。我們前期的研究結(jié)果顯示，單獨(dú)用5-ALA對(duì)STZ所致糖尿病小鼠的空腹血糖的影響不明顯。本研究在臨床報(bào)道和前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察5-ALA與二甲雙胍(metformine，Met)聯(lián)合用藥的降血糖作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 5-ALA，蘇州益安生物科技有限公司，批號(hào):20130127;鏈脲菌素(STZ):美國(guó)Sigma公司，臨用前用0.1 mol·L－1檸檬酸緩沖液(pH 4.4)配成1%的STZ溶液;Met:北京中惠藥業(yè)有限公司;檸檬酸亞鐵(FC):鄭州仁誠(chéng)化工產(chǎn)品有限公司;葡萄糖氧化酶試劑盒:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;葡萄糖注射液:中國(guó)大冢制藥有限公司。

2 方法

2.1 小鼠糖尿病模型制備及給藥 小鼠按150 mg·kg－1體重腹腔注射STZ，72 h后測(cè)空腹血糖，血糖值在11.1 mmol·L－1以上的即為糖尿病造模成功小鼠。隨機(jī)為5組，每組10只:模型組、Met組(334 mg·kg－1)、5-ALA 大劑量 +Met組(5-ALA 16.8 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)、5-ALA 中劑量 +Met組(5-ALA 8.4 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)、5-ALA 小劑量 +Met組(5-ALA 4.2 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)。另取10只同批健康小鼠作為正常對(duì)照組。連續(xù)灌胃給藥30 d。

2.2 樣品制備及檢測(cè) 給藥過(guò)程中監(jiān)測(cè)基本體征。末次給藥前禁食8h，給藥后30min，眼球后靜脈叢取血，用葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖，并留取血漿，用放免法測(cè)胰島素、瘦素(由北京華英生物技術(shù)研究所檢測(cè))，根據(jù)通用方法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA insulin resistance index，HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(HOMA insulin sensitivity index，HOMA-ISI)、β 細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA β-cell function index，HOMA-β)、定量胰島素敏感性檢測(cè)指數(shù)(quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)［9］。

2.3 糖耐量實(shí)驗(yàn) 另取一批小鼠，造模及給藥同“2.1”。末次給藥30 min后，給小鼠灌胃葡萄糖溶液(2 g·kg－1)，分別于0、30、60、120 min 取血，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，計(jì)算方法:分別為 0、30、60、120 min 血糖值)［10］。

2.4 組織病理學(xué)樣本制備 動(dòng)物放血處死后，取出肝臟、胰腺，10%福爾馬林液固定1個(gè)月，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩組間比較用方差分析(ONE WAY ANOVA)中的最小明顯差法(LSD)。

3 結(jié)果

3.1 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠基本體征的影響 模型組小鼠毛色枯槁，墊料潮濕，30 d平均體重僅增加1.47 g。給藥各組小鼠毛色均較模型組好，墊料潮濕情況較模型組減輕，平均體重增加均為6 g以上;12 h飲水量較模型組有所減少，添加5-ALA治療組基本體征改善更為明顯，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Influence of 5-ALA and Met on body weight and water intake in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Tab 1 Influence of 5-ALA and Met on body weight and water intake in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Group Dose/mg·kg－1 12 h Water Weight/g Before dosing After dosing Δvalue /ml Control － 28.42 ±2.51 48.18±2.97 19.76 4.7 Model － 28.46 ±2.53 29.93±4.47 1.47 26.8 Met 334 28.64 ±2.58 34.91 ±2.28 6.27 22.1 5-ALA+Met 4.2+334 28.81 ±2.07 35.02 ±3.65 6.21 21.4 5-ALA+Met 8.4+334 28.88 ±2.30 35.16 ±3.42 6.28 19.7 5-ALA+Met 16.8+334 28.25 ±2.99 35.21 ±3.22 6.96 18.2

3.2 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠空腹血糖、血漿胰島素、瘦素及胰島素敏感性的影響 如Tab 2所示，給藥各組空腹血糖均較模型組明顯下降(P＜0.05)，添加5-ALA治療組比單用Met組血糖下降更為明顯，且呈現(xiàn)5-ALA的劑量依賴性，添加5-ALA大、中劑量組與單用Met組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

模型組小鼠空腹血漿胰島素和瘦素均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。Met組血漿胰島素水平較模型組明顯升高(P＜0.05);添加5-ALA各治療組血漿胰島素水平與模型組差異無(wú)顯著性，而中、大劑量組較單用Met組降低(P＜0.05)。除添加小劑量5-ALA組外，各治療組血漿瘦素水平較模型組明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn) Fig 1、2。

單用Met組小鼠除HOMA-β較模型組明顯增高外，其他胰島素敏感性指標(biāo)與模型組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05);而添加5-ALA治療組胰島素敏感性指標(biāo)與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.05)，見(jiàn) Tab 3。

Tab 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum glucose in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Tab 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum glucose in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Glucose/mmol·L －1 Before dosing After dosing Control － 4.17 ±0.50 4.59 ±0.48 Model － 18.69 ±3.26 22.46 ±3.49 Met 334 18.32 ±3.09 16.41 ±3.27*5-ALA+Met 4.2+334 18.46 ±3.81 14.22 ±4.19*5-ALA+Met 8.4+334 18.07 ±3.36 12.07 ±3.06* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 18.57 ±3.82 10.94 ±4.21*Δ

Fig 1 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum insulin in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Fig 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum leptin in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

3.3 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠糖耐量的影響 給藥各組糖耐量均較模型組明顯改善，添加5-ALA治療組較單用Met組糖耐量改善更為明顯，且呈現(xiàn)明顯的5-ALA劑量依賴性。添加5-ALA大、中劑量組與單用Met比較，曲線下面積AUC明顯減小，見(jiàn)Tab 4。

3.4 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠肝臟及胰腺組織形態(tài)學(xué)影響 模型組小鼠肝臟肝細(xì)胞索排列紊亂，竇間隙消失，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變。給藥各組肝細(xì)胞排列均未見(jiàn)異常，單用Met組和添加5-ALA小劑量組，竇間隙較寬，見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Influence of 5-ALA and Met on liver tissues in diabetic mice induced by STZ

正常組小鼠胰腺中胰腺組織均勻，胰島飽滿，胰島內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間界限清晰，胞核呈卵圓形，胞質(zhì)均勻飽滿。模型組小鼠胰腺組織疏松，胰島數(shù)量較正常組明顯減少，胰島中細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)減少，胞核固縮;單用Met組胰島數(shù)量與模型組相似，但胰島中細(xì)胞胞質(zhì)較模型組飽滿;添加5-ALA各治療組胰島數(shù)量均較模型組和單用Met組明顯增多，胰島中細(xì)胞形態(tài)趨于正常，且呈現(xiàn)出一定的5-ALA劑量依賴性，見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Influence of 5-ALA and Met on pancreas tissues in diabetic mice induced by STZ

4 討論

5-ALA廣泛分布于各種生物中，通常由琥珀酰CoA與甘氨酸合成，然后脫水縮合生成膽色素原，后者成為血紅素、葉綠素、膽色素、維生素B12等四吡咯化合物生物合成的中間產(chǎn)物，參與氧的運(yùn)輸、生物合成、能量代謝等多種重要的生理過(guò)程［11］。臨床上5-ALA作為第2代光敏劑已被廣泛應(yīng)用于各種皮膚病、膀胱癌、尖銳濕疣、上消化道癌、直腸癌、乳腺癌、老年性黃斑變性、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療［12］。近年來(lái)，除了臨床研究報(bào)道5-ALA可延緩糖尿病前期病程的發(fā)展外，有學(xué)者在研究由于5-ALA脫水酶缺乏而造成的卟啉癥的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)5-ALA與糖代謝有著密切的關(guān)系［13］。大鼠口服5-ALA可抑制糖異生和糖原分解［14］。

Tab 3Influence of 5-ALA and Met on insulin-sensitivity in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Tab 3Influence of 5-ALA and Met on insulin-sensitivity in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Ln(HOMA-IR) Ln(HOMA-ISI) Ln(HOMA-β)0.52 ±0.009 Model － 3.02 ±0.348 －6.13 ±0.348 3.27 ±0.202 0.38 ±0.023 Met 334 2.92 ±0.188 －6.03 ±0.188 3.80 ±0.224* 0.38 ±0.011 5-ALA+Met 4.2+334 2.73 ±0.217 －5.97 ±0.217 3.87 ±0.418* 0.39 ±0.024*5-ALA+Met 8.4+334 2.52 ±0.276*Δ －5.64 ±0.276*Δ 4.00 ±0.421* 0.41 ±0.021*Δ 5-ALA+Met 16.8+334 2.36 ±0.199*Δ －5.24 ±0.199*Δ 4.25 ±0.457*Δ 0.42 ±0.015*Δ QUICKI Control － 1.32 ±0.077 －4.45 ±0.077 6.13 ±0.470

Tab 4Influence of 5-ALA and Met on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Tab 4Influence of 5-ALA and Met on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Glucose/mmol·L －1 0 min 30 min 60 min 120 min AUC/mmol·h·L －1±1.28 21.41 ±3.29 Model － 20.70 ±3.49 23.12 ±2.61 25.94 ±3.87 23.76 ±3.55 71.89 ±9.43 Met 334 15.78 ±2.60* 17.14 ±3.74* 20.55 ±4.07 19.85 ±4.37 55.50 ±10.57*5-ALA+Met 4.2+334 14.57 ±3.94* 16.88 ±3.54* 21.13 ±4.21 17.64 ±4.55* 54.12 ±12.10*5-ALA+Met 8.4+334 11.26 ±3.19*Δ 15.11 ±3.72* 20.01 ±4.32* 16.51 ±4.97* 47.98 ±15.59* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 10.49 ±3.71*Δ 11.58 ±4.70*Δ 18.85 ±4.46* 15.87 ±4.79* 42.82 ±13.49*Δ Control － 4.41 ±0.42 7.00 ±1.37 9.53 ±1.78 5.35

本研究根據(jù)國(guó)外臨床經(jīng)驗(yàn)，在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察5-ALA與Met聯(lián)合用藥的降血糖作用。結(jié)果顯示:添加5-ALA的治療組不僅比單用Met組小鼠整體狀態(tài)和糖尿病癥狀改善更為明顯，且其空腹血糖、糖耐量實(shí)驗(yàn)的曲線下面積均明顯降低，血漿胰島素、瘦素水平有所下降，胰島素敏感性改善也更為明顯。添加5-ALA的各治療組胰島數(shù)量均較模型組和單用Met組增多，肝組織和胰島中細(xì)胞形態(tài)趨于正常，且呈現(xiàn)出一定的5-ALA劑量依賴性。盡管有許多研究提出Met可改善胰島素抵抗［15］，但其降血糖作用還主要依靠促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，在增強(qiáng)其代償功能的同時(shí)，無(wú)疑加重了胰島β細(xì)胞負(fù)擔(dān)，所以Met組大鼠在表現(xiàn)出高血漿胰島素水平的同時(shí)，胰島β細(xì)胞的形態(tài)并未得到明顯改善。而加用5-ALA的糖尿病大鼠，其機(jī)體胰島素敏感性和瘦素抵抗得到進(jìn)一步改善，相對(duì)減輕了胰島β細(xì)胞負(fù)擔(dān)，保護(hù)了胰島的形態(tài)與功能，同時(shí)一定程度上緩解了機(jī)體的高胰島素、高瘦素狀態(tài)。本研究結(jié)果提示:5-ALA可通過(guò)提高胰島素敏感性、改善瘦素抵抗及保護(hù)肝臟和胰島的形態(tài)與功能等機(jī)制，明顯增強(qiáng)Met的降血糖、改善糖耐量的作用。

［1］Nishihara E，Kondo K，Parvez M M，et al.Role of 5-aminolevulinic acid(ALA)on active oxygen-scavenging system in NaCltreated spinach(Spinacia oleracea)［J］.J Plant Physiol，2003，160(9):1085－91.

［2］Balestrasse K B，Tomaro M L，Batlle A，Noriega G O.The role of 5-aminolevulinic acid in the response to cold stress in soybean plants［J］.Phytochemistry，2010，71(17 －18):2038 －45.

［3］Richter A，Peter E，Pors Y，et al.Rapid dark repression of 5-aminolevulinic acid synthesis in green barley leaves［J］.Plant Cell Physiol，2010，51(5):670 －81.

［4］Czarnecki O，Hedtke B，Melzer M，et al.An Arabidopsis GluTR binding protein mediates spatial separation of 5-aminolevulinic acid synthesis in chloroplasts［J］.Plant Cell，2011，23(12):4476 －91.

［5］Alster T S，Tanzi E L，Welsh E C.Photorejuvenation of facial skin with topical 20%5-aminolevulinic acid and intense pulsed light treatment:a split-face comparison study［J］.J Drugs Dermatol，2005，4(1):35 －8.

［6］Mikolajewska P，Donnelly R F，Garland M J，et al.Microneedle pre-treatment of human skin improves 5-aminolevulininc acid(ALA)-and 5-aminolevulinic acid methyl ester(MAL)-induced PpIX production for topical photodynamic therapy without increase in pain or erythema［J］.Pharmaceut Res，2010，27(10):2213 －20.

［7］Rodriguez B L，Curb J D，Davis J，et al.Use of the dietary supplement 5-aminiolevulinic acid(5-ALA)and its relationship with glucose levels and hemoglobin A1C among individuals with prediabetes［J］.Clin Transl Sci，2012，5(4):314 － 20.

［8］Higashikawa F，Noda M，Awaya T，et al.5-aminolevulinic acid，a precursor of heme，reduces both fasting and postprandial glucose levels in mildly hyperglycemic subjects［J］.Nutrition，2013，29(7－8):1030－6.

［9］Cao L，Mao C，Li S，et al.Hepatic insulin signaling changes:possible mechanism in prenatal hypoxia-increased susceptibility of fatty liver in adulthood［J］.Endocrinology，2012，153(10):4955－65.

［10］曹 莉，茅彩萍，顧振綸.葛根素對(duì)高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(12):1598－601.

［10］Cao L，Mao C P，Gu Z L.The effect of Puerarin on insulin sensitivity of the rats fed with high fat diet［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(12):1598 －601.

［11］Ano A，F(xiàn)unahashi H，Nakao K，Nishizawa Y.Effect of glycine on 5-aminolevulinic acid biosynthesis in heterotrophic culture of Chlorella regularis YA-603［J］.J Biosci Bioengin，1999，88(1):57 －60.

［12］Yang G，Xiang L F，Gold M H.5-Aminolevulinic acid-based photodynamic intense pulsed light therapy shows better effects in the treatment of skin photoaging in asian skin:a prospective，singleblinded，controlled trial［J］.J Clin Aesthet Dermatol，2010，3(3):40－3.

［13］Gross U，Sassa S，Jacob K，et al.5-Aminolevulinic acid dehydratase deficiency porphyria:a twenty-year clinical and biochemical follow-up［J］.Clin Chem，1998，44(9):1892 －6.

［14］Matkovic L B，D'Andrea F，F(xiàn)ornes D，et al.How porphyrinogenic drugs modeling acute porphyria impair the hormonal status that regulates glucose metabolism.Their relevance in the onset of this disease［J］.Toxicology，2011，290(1):22 －30.

［15］陳 梅，劉潤(rùn)俠.二甲雙胍對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠血清抑制素B、激活素A、卵泡抑素水平的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(10):1370 －3.

［15］Chen M，Liu R X.The effect of metformin on inhibin B，activin A and follistatin of polycystic ovary syndrome rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(10):1370 －3.