腎癌組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達(dá)變化及意義

劉國(guó)斌，單廣夷，孔垂?jié)?/p>

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽(yáng)110000;2寬甸中心醫(yī)院)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，且呈逐年上升趨勢(shì)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬磷酸肌醇激酶成員，主要控制細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞分化、凋亡起重要作用［1，2］。研究［3］表明，腫瘤中 mTOR表達(dá)失調(diào)［3］。核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，控制含5'-TOP結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯［4～7］，激活S6從而使核糖體40S小亞基易于結(jié)合翻譯復(fù)合物，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。本研究觀察了腎癌組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 109例腎癌組織均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2006～2008年手術(shù)切除標(biāo)本。腎癌患者中男51例、女58例，年齡34～81歲、平均53歲。按2004年WHO病理組織學(xué)分類，其中透明細(xì)胞癌94例，乳頭狀癌15例。組織學(xué)分級(jí):高分化50例，中分化37例，低分化22例。按ROBSON臨床分期，Ⅰ期46例，Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期28例。收集距離腫瘤邊緣5 cm外的正常腎臟組織20例作為對(duì)照，全部標(biāo)本術(shù)前均未接受化療及放療，標(biāo)本離體5 min內(nèi)經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，所有組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 主要試劑 mTOR多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司;P70S6K多克隆抗體購(gòu)于南京有為生物科技有限公司;DAB顯色系統(tǒng)購(gòu)自福州邁新公司;RIPA裂解液﹑GAPDH和β-actin購(gòu)于碧云天試劑公司;S-P免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.3 mTOR、P70S6K蛋白檢測(cè) 免疫組化檢測(cè):應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，結(jié)果判定:依據(jù)染色強(qiáng)度+陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分。①染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn):無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):同樣物鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。兩項(xiàng)得分相乘，滿3分為+，4、5分為++，6分以上為 +++，+～+++為陽(yáng)性表達(dá)。Western blotting實(shí)驗(yàn):提取蛋白，上樣電泳，濕轉(zhuǎn)后分別加入一抗mTOR(1∶200)，室溫下2 h。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗P70S6K(1∶2 000)，室溫下2 h。選取β-actin作為內(nèi)參照，用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌、正常腎組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達(dá) mTOR蛋白在腎癌、正常腎組織中的表達(dá)水平分別為1.223 ±0.125、0.667 ±0.106，兩者比較，P＜0.01;P70S6K在腎癌、正常腎組織的表達(dá)水平分別為 1.108 ±0.258、0.489 ±0.21，兩者比較，P ＜0.01。高、中、低分化腎癌中mTOR蛋白的表達(dá)分別為 0.72 ± 0.01、0.91 ± 0.07、1.24 ± 0.13，P70S6K蛋白的表達(dá)分別為 0.57 ±0.01、0.79 ±0.01、1.13±0.01。mTOR、P70S6K蛋白在腎癌各組織學(xué)分級(jí)間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。

2.2 mTOR、P70S6K蛋白表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 mTOR蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜中亦有著色，在109例腎癌組織中有87例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為79.8%。P70S6K蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，在109例腎癌組織中90例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為82.6%。mTOR、P70S6K蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腎癌的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P均＞0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 mTOR、P70S6K蛋白表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 腎癌組織中mTOR與P70S6K蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在87例mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性的腎癌組織中有84例P70S6K蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陰性表達(dá)有3例。而在22例mTOR蛋白表達(dá)陰性的腎癌組織中有16例P70S6K蛋白表達(dá)陰性，陽(yáng)性表達(dá)有6例。mTOR與 P70S6K 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.478，P=0.002)。

3 討論

腎癌在泌尿系腫瘤中較常見(jiàn)，僅次于膀胱癌。腎癌的病因未明，已明確與腎癌發(fā)病相關(guān)因素有遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等。TOR是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上保守的蛋白家族，在哺乳動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)一種TOR蛋白，即mTOR［6］，其相對(duì)分子質(zhì)量為289 kD，含有2 549個(gè)氨基酸殘基，對(duì)細(xì)胞的分化、凋亡起重要作用［1，2］。mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化可抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖，同時(shí)參與血管生成，在腫瘤形成中扮演重要角色，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。在體內(nèi)，mTOR通過(guò)磷酸化多種底物蛋白實(shí)現(xiàn)其生理作用。P70S6K是其重要的底物之一［9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mTOR和P70S6K蛋白在癌旁正常腎組織中均呈低表達(dá)，在腎癌組織中均呈高表達(dá)，mTOR和P70S6K蛋白的表達(dá)隨腎細(xì)胞癌分化程度的降低而升高，同一標(biāo)本中mTOR和P70S6K蛋白的表達(dá)有顯著的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)還觀察了mTOR和P70S6K蛋白在腎癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mTOR、P70S6K蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腎癌的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。我們認(rèn)為在腎癌中存在異?；罨膍TOR信號(hào)通路，而且mTOR的表達(dá)水平越高，mTOR下游的重要靶點(diǎn)P70S6K表達(dá)水平亦越高，從而使細(xì)胞中蛋白合成越快，細(xì)胞生長(zhǎng)越快，進(jìn)一步加速了細(xì)胞的惡化，mTOR和P70S6K蛋白的相互作用促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。

綜上可見(jiàn)，mTOR和P70S6K蛋白表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，可能作為腎癌的一個(gè)特異性治療靶點(diǎn)。

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