乙葵沖劑對雷公藤致雌鼠生殖系統(tǒng)毒性的預(yù)防作用

程吉東，溫淑云，楊大男

(德州市人民醫(yī)院，山東德州253014)

雷公藤作為一種植物藥，在臨床被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕免疫性疾病，療效肯定，但同時存在明顯的毒副作用。臨床及實驗證實，雷公藤對生殖系統(tǒng)有較大影響，如導(dǎo)致女性月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)、卵巢早衰，男性精子數(shù)量減少或無精子產(chǎn)生、不育，從而限制了其臨床應(yīng)用范圍［1］。2014年1～6月，我們觀察了乙葵沖劑對雷公藤致雌鼠生殖系統(tǒng)毒性的影響，旨在為臨床提供減毒用藥的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD小鼠40只，7～8周齡，由德州學(xué)院實驗動物房提供。雷公藤多苷片:國藥準(zhǔn)字Z33020422，由浙江得恩德制藥有限公司提供，10 mg/片。乙葵沖劑為自擬中藥方，由生地15 g、熟地15 g、肉蓯蓉30 g、山藥20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、菟絲子30 g、仙靈脾15 g、知母12 g、山萸肉9 g、丹參10 g、甘草6 g組成，藥物由單味中藥顆粒(廣州一方制藥有限公司生產(chǎn))配置成混懸液灌胃(相當(dāng)于成人量的15倍)。

1.2 實驗動物分組及處理 實驗前對每只雌性小鼠做陰道涂片10 d，選出連續(xù)2次為期4～5 d的正常性動周期小鼠30只，隨機分三組各10只，空白對照組不用任何藥物，雷公藤組給予雷公藤40 mg/(kg·d)，乙葵沖劑組給予雷公藤40 mg/(kg·d)加乙葵沖劑10 g/(kg·d)。三組均喂養(yǎng)90 d。實驗開始及結(jié)束10 d逐日做陰道涂片，以觀察脫落細胞，目的是選取正常性動周期動物(4～5次/d)、確定采血時間和觀察用藥后性動周期的變化。

1.3 血清孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)檢測 實驗前后各采血1次，時間在動情前期，由球后靜脈取血。采用ELISA法，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4 陰道、子宮濕重計算及子宮、卵巢形態(tài)學(xué)觀察 對小鼠采取乙醚麻醉，剖腹，取卵巢、子宮、陰道，以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。取子宮及陰道，以分析天平稱重，計算各組織臟器系數(shù)(臟器重量g/100 g體質(zhì)量)。卵巢以4%多聚甲醛+0.5%戊二醛混合液中固定。材料修塊后經(jīng)1%鋨酸固定2 h，制半薄切片(1 μm)，用瑞士吉姆薩染色定位，修塊后做80～100 nm超薄切片，行醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。組織稱重法計算卵巢、子宮指數(shù)，病理切片觀察各時段卵巢、子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組用藥前后血清 P、LH、E2、FSH水平比較結(jié)果見表1。

2.2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較 結(jié)果見表2。

表1 各組用藥前后血清P、LH、E2、FSH水平比較(±s)

表1 各組用藥前后血清P、LH、E2、FSH水平比較(±s)

注:與同組用藥前比較，﹟ P ＜0.05，*P ＜0.01;與雷公藤組比較，△P ＜0.05

組別 P(mIU/mL)LH(mIU/mL)E2(pmol/L)FSH(mIU/mL)6.39 ±1.33乙葵沖劑組用藥前 65.07 ±28.75 6.47 ±1.94 3.31 ±0.63 6.37 ±1.74用藥后 32.92 ±15.1＊△8.97 ±3.38﹟ 6.96 ±0.62＊△7.36 ±1.83雷公藤組用藥前 71.06 ±26.52 5.15 ±1.75 3.71 ±0.53 4.96 ±1.37用藥后 11.54 ± 3.25*7.26 ±2.83﹟ 1.21 ±0.33* 5.73 ±0.83空白對照組用藥前 57.86 ± 0.25 5.00 ±2.40 3.33 ±0.61 5.23 ±1.57用藥后 53.61 ± 0.57△ 6.11 ±3.10 3.37 ±0.65△

表2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較(g，±s)

表2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較(g，±s)

注:與同組用藥前比較，*P＜0.01;與空白對照組比較，△P＜0.01

組別 陰道濕重 子宮濕重0.011 ±0.002 0.020 ±0.003乙葵沖劑組用藥前 0.012 ±0.002 0.022 ±0.004用藥后 0.031 ±0.003＊△ 0.041 ±0.003＊△雷公藤組用藥前 0.013 ±0.001 0.025 ±0.002用藥后 0.002 ±0.001＊△ 0.011 ±0.005＊△空白對照組用藥前 0.012 ±0.001 0.021 ±0.005用藥后

2.3 各組小鼠子宮、卵巢形態(tài)學(xué)比較 結(jié)果見圖1～6?？瞻讓φ战M雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富，間質(zhì)細胞密度中等(圖1);卵巢體積大，卵泡生長活躍，可見各級卵泡，顆粒細胞層次多，卵泡液含量多，黃體發(fā)育好，體積大，黃體細胞豐富(圖4)。雷公藤組雌鼠子宮內(nèi)膜明顯變薄，腺體減少(圖2);卵巢體積萎縮，卵泡生長少，部分被纖維組織所代替，黃體數(shù)量少(圖5)。乙葵沖劑組雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富(圖3);卵巢體積大，卵泡生長多，顆粒細胞層次多，血供豐富，黃體細胞豐富(圖6)。

3 討論

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，歸肝、腎經(jīng)，味苦辛，性寒，有劇毒。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、祛風(fēng)除濕等功效，常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫系統(tǒng)疾病，療效顯著。然而，雷公藤廣泛應(yīng)用臨床并發(fā)揮治療作用的同時，長期使用該藥有明顯的生殖毒性，會導(dǎo)致女性月經(jīng)減少、閉經(jīng)及男子精子減少、不育等，其生殖毒性日益受到關(guān)注［2］。

圖1 空白對照組子宮HE染色(20×10)

圖2 雷公藤組子宮HE染色(20×10)

圖3 乙葵沖劑組子宮HE染色(20×10)

圖4 空白對照組卵巢HE染色(10×6)

圖5 雷公藤組卵巢HE染色(10×6)

圖6 乙葵沖劑組卵巢HE染色(10×6)

目前，已有眾多學(xué)者對雷公藤生殖毒性進行了大量的實驗研究，發(fā)現(xiàn)雷公藤制劑能降低子宮及卵巢臟器指數(shù)、可造成育齡期大鼠卵泡發(fā)育障礙和卵巢功能低下，損害卵巢功能及誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜凋亡基因的表達，使子宮管徑細，子宮內(nèi)膜上皮薄，腺體含量少，子宮肌層變薄，肌纖維排列較稀疏［3，4］。吳克明等［3］發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷可造成育齡期大鼠卵泡發(fā)育障礙和卵巢功能低下，表現(xiàn)為大鼠動情周期紊亂或消失，卵巢指數(shù)下降。于俊生等［4］給予大鼠雷公藤多苷灌胃，病理結(jié)果顯示其成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)減少，卵泡和黃體較小，子宮管徑細，子宮內(nèi)膜上皮薄，腺體含量少，子宮肌層變薄，肌纖維排列較稀疏。研究［3］報道，給予大鼠雷公藤多苷40 mg/kg灌胃后應(yīng)用放射免疫法檢測孕酮、雌二醇，結(jié)果顯示孕酮、雌二醇水平明顯下降。周昕欣等［5］認(rèn)為，雷公藤在病理、生理狀態(tài)下均能使孕酮降低，促濾泡素升高，促黃體生成素升高。王君等［6］給予小鼠灌服雷公藤多苷后取出卵母細胞，檢測卵母細胞的發(fā)育情況，并進行體外受精，認(rèn)為其可明顯降低小鼠成熟卵母細胞的體外受精率，對卵母細胞的質(zhì)量和存活也有顯著的破壞作用，提示雷公藤多苷通過降低卵母細胞的受精能力和存活率而影響小鼠的生殖能力。研究［8］報道，雷公藤多苷使Bcl-2基因表達降低，Bax基因表達升高，說明雷公藤可以導(dǎo)致性腺抑制，誘導(dǎo)凋亡基因表達，最終使子宮內(nèi)膜細胞過度凋亡。

《黃帝內(nèi)經(jīng).素問.六節(jié)藏象論篇》曰:“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，可見五臟之中，腎與生殖功能關(guān)系最為密切，生殖功能受腎氣調(diào)控，生殖功能低下當(dāng)責(zé)之于腎虛，腎精、腎氣虧虛是生殖功能低下的根源。雷公藤之藥毒進入人體后，一方面直接耗傷精血，使臟腑缺乏氣化的物質(zhì)基礎(chǔ)，而致臟腑功能失調(diào);另一方面通過損傷臟腑(主要為腎)，使氣血津液的生成、輸布、排泄障礙，導(dǎo)致濕、痰、瘀、毒留于體內(nèi)，使損傷更重。因此，雷公藤所致雌性小鼠生殖功能低下當(dāng)責(zé)之于其對腎精、腎氣的損傷，腎精腎氣虧損，則“腎主生殖”的功能減退。自擬方乙葵沖劑由六味地黃湯加味，六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，為宋代錢乙所創(chuàng)，是傳統(tǒng)中醫(yī)“滋陰補腎”的經(jīng)典名方，使用已近千載。其功效是滋陰補腎，兼益肝陰［8］?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，乙葵沖劑能改善腎功能，促進腎臟對體內(nèi)代謝產(chǎn)物尿素等的排泄［9］。方中生熟地、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉，滋腎陰、養(yǎng)精血;肉蓯蓉、菟絲子、仙靈脾溫補腎陽，肉蓯蓉“主五勞七傷，補中，除莖中寒熱，養(yǎng)五臟，強陰益精氣，多子”，既能溫通腎陽，又能滋養(yǎng)精血［10］?，F(xiàn)代研究［11］表明，肉蓯蓉具有雄性激素作用和促性腺激素樣作用，能發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)分泌腺軸的功能，促進精子發(fā)生，使睪丸生精功能增強;生地熟地并用取陰陽平衡之意，與知母、丹參同用使組方補而不熱，體現(xiàn)了“善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”的觀點，全方的配伍注重寓調(diào)節(jié)腎的陰陽平衡于補腎之中，以平為期，補陰之中寓有補陽之用，共達補腎精、養(yǎng)精血、化瘀血之功。

本研究顯示，乙葵沖劑能增加應(yīng)用雷公藤小鼠陰道、子宮重量，光鏡下雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富卵巢體積大，卵泡生長多，顆粒細胞層次多，血供豐富，黃體細胞豐富;孕酮水平下降幅度明顯小于雷公藤組;促黃體生成素水平上升，與其他兩組比較無差異。說明乙葵沖劑可以拮抗雷公藤多苷對雌鼠生殖系統(tǒng)的毒副作用，對于雌鼠生殖系統(tǒng)具有保護作用，從而為臨床提供減毒用藥的理論依據(jù)，解決臨床上由于長期服用雷公藤多苷導(dǎo)致女性月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)問題。

［1］Gyles CL.Escherichia coli cyloxins and enteroxin s［J］.Can J Microbiol，1992，38(7):734.

［2］阮寧，施毅.雷公藤多甙的毒副作用分析［J］.實用醫(yī)技雜志，2007，14(26):3687-3688.

［3］吳克明，付雨，吳也可，等.通脈大生片對雷公藤致卵巢損傷大鼠卵巢激素與卵泡發(fā)育的影響［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，34(3):25-28.

［4］于俊生，王瑤瑤.益腎飲拮抗雷公藤多苷對系膜增生性腎炎雌性大鼠性腺損害的研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2009，28(3):192-194.

［5］周昕欣，梁茂新.基于雷公藤毒性配伍組方對腎病雌性大鼠生殖系統(tǒng)影響的研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(4):56-58.

［6］王君，于智勇，薛慶於，等.雷公藤多甙對小鼠卵母細胞成熟和體外受精的影響［J］.生物學(xué)雜志，2009，26(5):48-50.

［7］毛黎明，殷子杰，王軍，等.益腎調(diào)經(jīng)方對雷公藤多苷致性腺抑制的腎病大鼠子宮內(nèi)膜bcl-2/bax基因表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(5):1030-1032.

［8］于世良，史定文.中藥名方精解［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1993:136.

［9］張艷，劉畫建.六味地黃丸的藥理研究進展［J］.國醫(yī)論壇，2004，19(2):50-52.

［10］黃爽輯.神農(nóng)本草經(jīng)［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1982:73.

［11］陶婷婷，呂伯東，黃曉軍.單味中藥治療弱精子癥的研究現(xiàn)狀［M］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32(3):421-422.