大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中血流動力學(xué)及炎癥因子的表達(dá)變化

郭志祥，汪 歡，張成鑫，葛圣林

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230022）

急性心肌梗死（AMI）最有效的治療方法是盡早行再灌注治療［1，2］，但再灌注損傷是無法避免的問題。心肌缺血時，新陳代謝障礙，從而繼發(fā)一系列功能障礙;但當(dāng)缺血心肌組織血流恢復(fù)后，會出現(xiàn)組織細(xì)胞損傷加重的病理狀態(tài)，導(dǎo)致心肌功能障礙或心律失常，稱為心肌缺血再灌注損傷［3］。炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素［4，5］。2013年10月～2014年4月，我們建立了大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察再灌注后血流動力學(xué)變化，及心肌組織與不同時段血清炎癥因子白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)變化。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠30只（香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量250～300 g。MODEL 683動物呼吸機(jī)（Harvard公司，美國），PowerLab Systems心電記錄儀（AD 公司，澳大利亞），IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購自美國Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只大鼠隨機(jī)分為 A、B組各15只，A組制備心肌缺血再灌注損傷模型:大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉75 mg/kg麻醉，經(jīng)口氣管插管，接呼吸機(jī)機(jī)械通氣（吸入氣體為室內(nèi)空氣混入0.5 L/min氧氣），設(shè)置潮氣量2～3 mL/100 g，通氣頻率60～80次/min，吸呼比1∶1，維持PETCO230～40 mmHg。行右頸總動脈切開置管，接壓力換能器，連接心電記錄儀記錄心電圖（ECG）、平均血壓（MAP）、心率（HR）;右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管，用于采集血樣及給藥。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在4、5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟，用6-0 PROLENE縫線作一線結(jié)，在左冠狀動脈前降支下穿過，穩(wěn)定10 min后拉緊結(jié)扎線30 min，造成局部心肌缺血。表現(xiàn)為左冠狀動脈所支配的局部心肌出現(xiàn)發(fā)紺，血壓下降，ECG出現(xiàn)心肌梗死改變（如ST-T升高或壓低等）。松開結(jié)扎線后，抬高ST段可相對降低（＞50%），血壓恢復(fù)，且缺血區(qū)心外膜顏色恢復(fù)紅潤作為再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)［6］。B組僅在左冠狀動脈前降支下穿線不結(jié)扎。

1.2.2 血流動力學(xué)觀察 缺血前即刻、缺血30 min及再灌注 30、60、120 min 時記錄 HR、MAP，并計(jì)算心肌氧耗指數(shù)（RPP為HR和MAP的乘積）。

1.2.3 血清炎癥因子檢測 分別于上述時點(diǎn)采集血清標(biāo)本，ELISA 法檢測血清 IL-1、IL-6、TNF-α，按試劑盒說明書操作。

1.2.4 心肌組織炎癥因子檢測 采集完血樣，A組再次結(jié)扎左冠狀動脈前降支，取前降支結(jié)扎線下2 mm至心尖部左心室缺血心肌組織100 mg;搗碎組織，按1 mg/L加入含蛋白酶抑制劑與細(xì)胞裂解液的混合物4℃過夜;以20 000 r/min離心20 min，取上清于-80℃保存待測。B組在心臟同樣部位穿線但不結(jié)扎，于相同時間點(diǎn)采用相同方法采集標(biāo)本。操作過程同血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測，同時用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法檢測每個組織標(biāo)本的蛋白含量，得出數(shù)值后，將勻漿液中的細(xì)胞因子含量（mL）換算成蛋白中的細(xì)胞因子含量（mg）。

1.2.5 心肌組織學(xué)觀察 取部分心肌組織固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色壓片;顯微鏡下觀察心臟病理形態(tài)以及炎癥細(xì)胞分布情況，由同一個觀察者按照單盲的原則評估。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組各時點(diǎn)血流動力學(xué)變化 見表1。

2.2 兩組各時點(diǎn)血清 IL-1、IL-6、TNF-α 比較 見表2。

2.3 兩組心肌組織 IL-1、IL-6、TNF-α 表達(dá)比較見表3。

2.4 兩組心肌組織病理表現(xiàn) A組可見心肌組織紋理紊亂，細(xì)胞核不規(guī)則，并出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤;B組可見心肌細(xì)胞排列整齊，組織紋理清晰，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。

表1 兩組大鼠各時點(diǎn)血液動力學(xué)變化（±s，n=15）

表1 兩組大鼠各時點(diǎn)血液動力學(xué)變化（±s，n=15）

注:與同組缺血前即刻比較，*P＜0.05;與B組同時點(diǎn)比較，#P ＜0.05

組別HR（次/min）MAP（mmHg）RPP［×103，（mmHg·次）/min］A 組缺血前即刻 353±18 124±15 56±8缺血30 min 359±21 126±13# 47±6*再灌注30 min 360±21 109±16*# 43±7*#再灌注60 min 355±19 100±13*# 40±5*#再灌注120 min 352±20 91±9*# 40±5*#B組缺血前即刻 345±16 129±16 51±7缺血30 min 351±19 135±14 52±8再灌注30 min 356±23 123±17 52±8再灌注60 min 352±17 118±15 49±7再灌注120 min 347±18 110±13 47±7

表2 兩組大鼠各時點(diǎn)血清IL-1、IL-6、TNF-α比較（ ±s，n=15）

表2 兩組大鼠各時點(diǎn)血清IL-1、IL-6、TNF-α比較（ ±s，n=15）

注:與同組缺血前即刻比較，*P＜0.05;與B組同時點(diǎn)比較，#P＜0.05

組別IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（×103，pg/mL）A 組缺血前即刻 146±18 283±41 1.53±0.26缺血30 min 198±28*# 398±28*# 1.92±0.32*#再灌注30 min 255±28*# 521±37*# 2.22±0.34*#再灌注60 min 367±30*# 567±42*# 3.83±0.42*#再灌注120 min 418±24*# 592±40*# 4.11±0.48*#B組缺血前即刻 143±17 277±38 1.46±0.13缺血30 min 144±18 284±40 1.49±0.21再灌注30 min 151±15 279±44 1.50±0.18再灌注60 min 145±21 282±39 1.52±0.24再灌注120 min 142 ±8 276 ±42 1.55 ±0.28

表3 兩組大鼠心肌組織中IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（pg/mg， ±s，n=15）

表3 兩組大鼠心肌組織中IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（pg/mg， ±s，n=15）

注:與 B 組比較，*P ＜0.05

組別 IL-1 IL-6 TNF-α A 組 33.15 ±3.63* 36.72 ±3.45* 9.23 ±0.93*B組14.20 ±1.83 16.26 ±2.40 5.26 ±1.01

3 討論

1960年Jennings等［7］首次描述了心肌缺血再灌注損傷這一現(xiàn)象，隨后該現(xiàn)象引起了人們的廣泛關(guān)注。缺血再灌注損傷指在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流供應(yīng)后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象［8］，心肌組織中可表現(xiàn)為心肌的舒縮功能降低、心律失常、心肌頓抑、微循環(huán)障礙等，其中一些表現(xiàn)為可逆性［9］。目前，關(guān)于炎癥因子在缺血再灌注損傷中的作用研究較廣泛，且研究結(jié)論富有爭議。大多數(shù)動物實(shí)驗(yàn)表明，在心肌缺血再灌注過程中，促炎因子表達(dá)升高，且兩者具有一定相關(guān)性;但在臨床工作中，對于心肌缺血再灌注損傷的高?；颊邞?yīng)用細(xì)胞因子抑制劑治療時卻收效甚微［10］。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了大鼠心肌缺血再灌注早期的血流動力學(xué)變化和炎癥因子在血清及心肌中的表達(dá)情況。本研究顯示，在大鼠心肌缺血再灌注損傷早期，心肌舒縮功能受到抑制，且呈逐漸加重趨勢，大鼠血清 IL-1、IL-6、TNF-α 水平持續(xù)升高，缺血區(qū)域心肌的炎癥因子表達(dá)較前亦有顯著增高。原因可能為缺血再灌注作為一種應(yīng)激刺激，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子的活化，黏附分子的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子大量產(chǎn)生;另外，心肌舒縮功能受到抑制時灌注壓降低、腎濾過率下降可導(dǎo)致某些炎癥因子的清除減緩，從而引起血清中炎癥因子水平升高。

已有研究表明，心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時，激活的補(bǔ)體能夠刺激肥大細(xì)胞，釋放出TNF-α。作為一種炎性細(xì)胞介質(zhì)，TNF-α可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、激活中性粒細(xì)胞釋放氧自由基和彈性蛋白酶等，在體外循環(huán)中參與自身組織的破壞、內(nèi)皮損傷等過程。其是機(jī)體受到應(yīng)激刺激后最初分泌的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)其他多種因子的產(chǎn)生，如IL-1。IL-1在血漿和組織液中的主要形式為IL-1β，能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子共同促進(jìn)B、T細(xì)胞活化，且能誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α生成，激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)氧自由基產(chǎn)生、活化中性粒細(xì)胞、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等，加重心肌缺血再灌注損傷［11］。Legendre 等［12］研究表明，缺血再灌注可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。IL-6處于炎癥反應(yīng)調(diào)控的樞紐位置，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可刺激中性粒細(xì)胞、心肌細(xì)胞表面分別表達(dá)CD11b/CD18及細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1），介導(dǎo)其與心肌細(xì)胞結(jié)合，從而損傷心肌。近期的基因功能染色體分析顯示，IL-6信號通路也參與了局部炎癥的遠(yuǎn)隔效應(yīng)［13］。IL-6基因敲除的急性腎損傷小鼠，其遠(yuǎn)隔器官肺損傷有所減輕、炎癥因子的表達(dá)亦降低。促炎因子不僅能夠引起心肌收縮力減弱，同時還促使心肌細(xì)胞肥大、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)胚胎型蛋白、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此可見，3種促炎因子互相作用，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，激活成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化，促進(jìn)氧自由基及溶酶體酶的釋放，進(jìn)而損傷心肌;破壞凝血平衡，促進(jìn)微血栓形成，阻塞心肌供血的小血管，加重缺血再灌注損傷，進(jìn)一步促使促炎因子生成，產(chǎn)生惡性循環(huán)。有學(xué)者稱，急性心肌梗死后的一段時間內(nèi)，會出現(xiàn)多種炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)，而炎性因子的表達(dá)水平增高與患者心臟舒縮功能的減退直接相關(guān)。因此，在急性心肌梗死的早期干預(yù)治療過程中，尤其是在缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中，炎性胞因子起著明顯的負(fù)面作用。若能夠抑制急性心肌梗死后炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，則可以延緩心室重塑過程，保護(hù)心臟相關(guān)功能。

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