糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)變化

劉 宸，章宏偉，徐 寧，崔毓桂

0 引 言

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增高，糖尿病性創(chuàng)面愈合障礙的發(fā)生率也在不斷上升。在我國(guó)，因創(chuàng)面因素入院的患者中糖尿病患者已達(dá)36%，占首位［1］。糖尿病是一種慢性炎性反應(yīng)疾病，其固有免疫炎癥細(xì)胞的功能障礙涉及全身各個(gè)系統(tǒng)［2-3］。糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的表型和功能均可發(fā)生改變，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)失調(diào)引起各種并發(fā)癥［4-6］。同樣，也有研究顯示糖尿病性創(chuàng)面常處于異常的炎性反應(yīng)環(huán)境中，并伴有巨噬細(xì)胞為主要來(lái)源的炎癥因子分泌障礙，這提示糖尿病性創(chuàng)面的愈合過(guò)程中也存在著失調(diào)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)［7-8］。本文擬通過(guò)觀察糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過(guò)程中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量及炎癥因子表達(dá)量變化情況，初步探討其與糖尿病鼠創(chuàng)面愈合障礙間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，35只，6～7周齡，體重180～220g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2013-0005。普通飼養(yǎng)環(huán)境，室溫控制于18～25℃，相對(duì)濕度50%，12 h光照12 h黑夜交替。普通顆粒飼料投喂，專人供水，創(chuàng)面造模前每籠5只，創(chuàng)面造模成功后單只單籠飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)條例，實(shí)驗(yàn)人員具備江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從業(yè)人員資質(zhì)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素(Sigma公司)，小鼠抗大鼠CD68(Santa Cruz公司)，羊抗大鼠CCR7(Novus公司)，小鼠IgG SABC試劑盒及羊IgG FITCSABC試劑盒(武漢博士德公司)，Trizol、預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Premix試劑盒(Takara公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型建立 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，檢測(cè)尾靜脈隨機(jī)血糖，血糖異常者剔除［9］。按隨機(jī)數(shù)字表法選取20只大鼠，稱重后按55 mg/kg劑量腹腔注射檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.5)稀釋的鏈脲佐菌素，稀釋濃度為4 mg/mL。72 h后檢測(cè)尾靜脈隨機(jī)血糖，血糖值＞16.7 mmol/L者入選，分別于造模1、3、8周后復(fù)測(cè)尾靜脈血糖。血糖持續(xù)＞16.7mmol/L達(dá)8周者視為糖尿病模型成模鼠入組。建模期間所有大鼠正常飲食，適當(dāng)供給蛋白質(zhì)。除外糖尿病造模過(guò)程中血糖恢復(fù)或因血糖波動(dòng)死亡鼠，最終入組糖尿病鼠15只。

1.3.2 創(chuàng)面模型建立 糖尿病模型成模鼠為模型組，健康同齡對(duì)照鼠為對(duì)照組，每組15只，于術(shù)前1 d背部備皮，手術(shù)當(dāng)天腹腔注射水合氯醛(30 mg/kg)麻醉。常規(guī)消毒大鼠背部后，距大鼠顱后線3 cm背部正中處美蘭標(biāo)記，用手術(shù)刀及眼科剪造1 cm2全層皮膚缺損，紗布止血，數(shù)碼照相后貼膜覆蓋，膠布固定包扎。

1.3.3 創(chuàng)面取材 2組在創(chuàng)面形成后第3、7、14天分別按隨機(jī)數(shù)表法各抽取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉后，數(shù)碼照相，距創(chuàng)緣外2mm處切取創(chuàng)周及全部創(chuàng)面肉芽組織，行形態(tài)學(xué)、免疫組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.3.4 創(chuàng)面愈合率 計(jì)算公式如下:

創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%

1.3.5 組織形態(tài)學(xué) 4%甲醛固定組織，經(jīng)乙醇梯度脫水后二甲苯透明，石蠟包埋，切5 μm厚切片，再經(jīng)脫蠟至水，行HE染色，光鏡觀察創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.6 巨噬細(xì)胞標(biāo)記和計(jì)數(shù) 創(chuàng)面組織切片脫蠟至水，后續(xù)過(guò)程依小鼠IgG即用型SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中一抗為小鼠抗大鼠 CD68 1∶50。DAB顯色，中性樹(shù)膠封片后，顯微鏡下每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下CD68+細(xì)胞平均數(shù)。

1.3.7 創(chuàng)面組織中IL-12B、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α 的 mRNA 測(cè)定 凍存組織取出后，采用Trizol法抽提出組織總RNA，經(jīng)預(yù)混反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green Premix試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物訂購(gòu)自Invitrogen公司，引物序列如下:GUSB上游5'-TGAGAATCAACAGCGCCCAT-3'，下游 5'-CCTCCCTCATGTTCCACCAC-3';IL-12B上游5'-AGAAGTACTCAGTGGCGTGC-3'，下游 5'-GGTGGGTCCGGTTTGATGAT-3';iNOS上游5'-ACACAGTGTCGCTGGTTTGA-3'，下游 5'-AACTCTGCTGTTCTCCGTGG-3';TNF-α 上游 5'-CATCCGTTCTCTACCCAGCC-3'，下 游 5'-AATTCTGAGCCCGGAGTTGG-3';其中 β-葡萄糖苷酸酶(Glucuronidase，Beta Elisa Kit，GUSB)為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件:95℃ 1min，95℃ 15s、60℃ 1min，共40 個(gè)循環(huán)，采用2-ΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 創(chuàng)面組織CCR7熒光染色 創(chuàng)面組織切片脫蠟至水，后續(xù)過(guò)程依羊IgG FITC-SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中一抗為羊抗大鼠 CCR7 1:100?？篃晒獯銣绶馄瑒┓夤毯?，倒置熒光顯微鏡觀察高倍視野下CCR7陽(yáng)性細(xì)胞染色情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。圖像數(shù)據(jù)采用Image J軟件系統(tǒng)處理。兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，指標(biāo)間采用Pearson直線相關(guān)分析，P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率 在術(shù)后第3、7、14天時(shí)，模型組的創(chuàng)面愈合率均低于對(duì)照組［(29.5±5.4)%vs(45.9 ± 12.8)%、(71.6 ± 3.1)%vs(80.1 ±6.9)%、(93.9 ±2.8)%vs(99.4 ±1.4)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果 術(shù)后第3天時(shí)，對(duì)照組創(chuàng)面組織中可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而模型組創(chuàng)面組織中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度較低;2組術(shù)后第7天時(shí)均有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);術(shù)后第14天時(shí)對(duì)照組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度較第7天時(shí)明顯降低，而模型組創(chuàng)面中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度變化不明顯，且模型組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度明顯高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

2.3 創(chuàng)面組織CD68染色結(jié)果 術(shù)后第3天模型組創(chuàng)面中巨噬細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);術(shù)后第7天2組創(chuàng)面內(nèi)均可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，其中模型病組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后第14天可見(jiàn)模型組和對(duì)照組創(chuàng)面中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度較各自組第7天均有所下降，但模型組創(chuàng)面中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度仍明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 糖尿病大鼠與對(duì)照大鼠創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況(HE×200)Figure 1 Infiltration of inflammatory cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(HE×200)

圖2 糖尿病大鼠與對(duì)照大鼠創(chuàng)面組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度(免疫組化染色 ×400)Figure 2 Infiltration densities of macrophagocytes between the rats from DM group and control group(IHC×400)

圖3 糖尿病大鼠與對(duì)照大鼠創(chuàng)面組織CD68+細(xì)胞數(shù)比較Figure 3 The amount CD68 of positive cells of the wound tissue at different time points

2.4 創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞數(shù)和創(chuàng)面愈合率的相關(guān)性分析結(jié)果 針對(duì)本實(shí)驗(yàn)2組小鼠，術(shù)后第3天時(shí)，創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)和創(chuàng)面愈合率呈正相關(guān)(r=0.909，P＜0.01);術(shù)后第7天時(shí)兩者間無(wú)相關(guān)性(r=-0.135，P ＞0.05);術(shù)后第 14 天時(shí)兩者間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.962，P ＜0.01)。見(jiàn)圖4。

2.5 創(chuàng)面組織中炎癥因子mRNA的檢測(cè)結(jié)果 第3天時(shí)，模型組 IL-12B、iNOS、TNF-α 的 mRNA 表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第7天時(shí)模型組IL-12B、iNOS的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而TNF-α的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在第 14 天時(shí)模型組 IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖4 創(chuàng)面巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度和創(chuàng)面愈合率的相關(guān)性分析Figure 4 Correlation of wound macrophage density with the wound closure rate

表1 創(chuàng)面組織IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

表1 創(chuàng)面組織IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

分組 n IL-12B mRNA第3天 第7天 第14天mRNA第3天 第7天 第14天iNOS的mRNA第3天 第7天 第14天TNF-α的對(duì)照組 5 0.141 ±0.015 0.012 ±0.001 0.028 ±0.001 14.455 ±0.463 0.797 ±0.030 0.029 ±0.004 1.472 ±0.273 0.781 ±0.106 0.643 ±0.122模型組 5 0.055 ±0.015 0.057 ±0.019 0.134 ±0.026 11.206 ±1.897 0.946 ±0.058 0.279 ±0.045 1.023 ±0.038 0.359 ±0.126 1.038 ±0.115 t值 -6.911 4.304 7.157 -2.882 3.941 9.572 -2.814 -4.431 4.084 P 值 0.002 0.049 0.019 0.045 0.017 0.001 0.048 0.011 0.015

2.6 CCR7免疫熒光染色結(jié)果 術(shù)后第3天時(shí)，2組創(chuàng)面內(nèi)均出現(xiàn)多量陽(yáng)性染色細(xì)胞，而模型組創(chuàng)面組織內(nèi)陽(yáng)性染色細(xì)胞較對(duì)照組稀疏。術(shù)后第7天時(shí)，2組均有大量陽(yáng)性染色細(xì)胞。術(shù)后第14天時(shí)，可見(jiàn)模型組創(chuàng)面內(nèi)仍殘留有較多陽(yáng)性染色細(xì)胞，而對(duì)照組僅殘留極少數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞。見(jiàn)圖5。

圖5 糖尿病大鼠與對(duì)照大鼠創(chuàng)面組織陽(yáng)性染色細(xì)胞比較結(jié)果(CCR7熒光染色 ×400)Figure 5 Comparison of positive staining cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(×400)

3 討 論

炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面愈合過(guò)程中的起始步驟，適度的炎癥反應(yīng)有助于創(chuàng)面的正常愈合［10-11］。作為創(chuàng)面中的主要炎癥反應(yīng)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中炎癥反映的調(diào)節(jié)具有重要意義［12-14］。目前，創(chuàng)面中已知的巨噬細(xì)胞可以具有M1型(經(jīng)典活化型，即促炎癥型)和M2型(選擇活化型，即促血管型)2種極化狀態(tài)。其中M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)能力，可以合成大量iNOS并分泌大量炎癥因子如IL-12、IL-23、TNF-α 等，對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用［15-17］。正常情況下，M1巨噬細(xì)胞出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期，分泌大量的炎癥因子和炎癥趨化因子，從而促進(jìn)創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)創(chuàng)面壞死組織和細(xì)胞清除，防止細(xì)菌侵襲。在完成炎癥反應(yīng)過(guò)程后巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面局部的浸潤(rùn)密度逐漸降低，殘余巨噬細(xì)胞也轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞，同時(shí)其炎癥因子的表達(dá)量逐漸下降，抗炎癥因子的分泌增強(qiáng)，從而減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的細(xì)胞增殖和血管化的形成［18-20］。糖尿病狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞表型發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量和比例增高［21］，同時(shí)其分泌的炎癥因子水平上升，但其刺激活化后的炎癥因子表達(dá)能力和吞噬能力卻明顯減弱［6，22］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病大鼠創(chuàng)面中的巨噬細(xì)胞早期浸潤(rùn)數(shù)量較低與創(chuàng)面愈合率具有正相關(guān)性，而晚期殘留巨噬細(xì)胞數(shù)量較多且與創(chuàng)面愈合率具有負(fù)相關(guān)性。同時(shí)IL-12、IL-23、iNOS 、TNF-α mRNA 表達(dá)量的變化與之基本吻合，其為創(chuàng)面愈合過(guò)程中具有代表性的炎癥因子，主要由M1巨噬細(xì)胞表達(dá)分泌，其mRNA表達(dá)量的高低反映了巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)及創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。本研究選擇IL-12B作為評(píng)估IL-12和IL-23 mRNA表達(dá)量的指標(biāo)是因?yàn)镮L-12B(即IL-12p40)是IL-12和IL-23共有的亞基，決定著IL-12和IL-23的合成量，并與炎癥的強(qiáng)度密切相關(guān)［23］。目前，關(guān)于M1型巨噬細(xì)胞的表面特異性標(biāo)記尚未達(dá)成共識(shí)，本研究選擇CCR7作為評(píng)估創(chuàng)面M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，是因?yàn)镃CR7在人和動(dòng)物的M1型巨噬細(xì)胞中都具有較好的代表性［24］。然而需注意的是CCR7有時(shí)也在淋巴細(xì)胞和部分樹(shù)突狀細(xì)胞的亞群中有所表達(dá)［25］，由于這些細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中的浸潤(rùn)數(shù)量遠(yuǎn)低于巨噬細(xì)胞［26］，所以雖然不能采取定量的方法比較2組創(chuàng)面內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，但結(jié)合鏡下所見(jiàn)的圖像和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況，依然可以推測(cè)出糖尿病創(chuàng)面愈合晚期時(shí)仍有多量M1型巨噬細(xì)胞殘留。Mirza等［27］發(fā)現(xiàn)術(shù)后第10天時(shí)糖尿病創(chuàng)面中仍然留有較多的M1型巨噬細(xì)胞，同時(shí)伴有生長(zhǎng)因子表達(dá)量的下降和炎癥因子表達(dá)量的上升。愈合晚期增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)不利于創(chuàng)面的愈合，可以導(dǎo)致創(chuàng)面上皮化的失敗和血管化的困難，然而導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面晚期炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的原因，目前并不明確。

創(chuàng)面愈合早期適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)有助于創(chuàng)面的正常愈合，正常巨噬細(xì)胞在吞噬和清除凋亡的組織和細(xì)胞后其炎癥因子分泌功能下降，逐漸凋亡并被其他巨噬細(xì)胞吞噬清除［28］。同時(shí)巨噬細(xì)胞分泌的部分炎癥因子可以有效刺激抗炎癥因子的分泌，加速炎癥反應(yīng)的消退，例如IL-12可以經(jīng)由負(fù)反饋機(jī)制刺激抗炎癥因子IL-10的分泌［29］。而糖尿病狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞吞噬速度較正常慢5倍以上［30］，可能導(dǎo)致創(chuàng)面壞死組織及調(diào)往細(xì)胞清除較慢持續(xù)趨化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)已趨化至創(chuàng)面的巨噬細(xì)胞也無(wú)法順利完成凋亡過(guò)程，并且由于炎癥因子的分泌功能下降，糖尿病創(chuàng)面不能形成有效的負(fù)反饋機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致了愈合后期創(chuàng)面巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增多、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第3天時(shí)創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)與創(chuàng)面愈合率呈正相關(guān)性，但模型組創(chuàng)面內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯低于對(duì)照組，且炎癥反應(yīng)強(qiáng)度較弱，提示創(chuàng)面內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量不足，無(wú)法完成有效的炎癥反應(yīng)過(guò)程，并且由于糖尿病狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞吞噬及炎癥因子表達(dá)功能均受損，更降低了愈合早期的炎癥反應(yīng)效能，導(dǎo)致了后期持續(xù)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。

糖尿病作為一種全身系統(tǒng)性疾病，其創(chuàng)面巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能的障礙僅僅是全身病變?cè)诰植康谋憩F(xiàn)，患者全身免疫炎癥的狀態(tài)也會(huì)對(duì)創(chuàng)面的愈合產(chǎn)生不良影響。本實(shí)驗(yàn)僅初步證明了STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠創(chuàng)面模型中巨噬細(xì)胞早期浸潤(rùn)密度較低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度較低，而晚期持續(xù)停留于創(chuàng)面且炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，這可能與糖尿病創(chuàng)面愈合障礙有一定的相關(guān)性。

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