嚴(yán)重燙傷小鼠主要器官自噬變化的實(shí)驗(yàn)研究

孫春紅，陳 剛，王鳳君，閆柏剛

0 引 言

自噬(Autophagy)即自體吞噬，是生物體通過(guò)溶酶體或囊泡降解胞內(nèi)成分的總稱，系指來(lái)源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)核糖體附著區(qū)的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新［1-2］。目前的研究認(rèn)為，自噬不僅在細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)育中起重要作用，而且在應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激及多種疾病如缺血缺氧性損害、炎癥反應(yīng)等的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2-6］。但嚴(yán)重?zé)齻笃鞴俳M織細(xì)胞的具體自噬情況，以及在燒傷后器官結(jié)構(gòu)和功能的改變中發(fā)揮何種作用，目前尚無(wú)相關(guān)研究資料。本研究利用BALB/C小鼠建立30%TBSA的Ⅲ度體表燙傷模型，動(dòng)態(tài)觀察嚴(yán)重燙傷早期心、肝、肺、腎實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞自噬的變化，旨在了解嚴(yán)重?zé)齻麑?duì)組織細(xì)胞自噬的影響，為進(jìn)一步研究自噬在嚴(yán)重?zé)齻笃鞴俳Y(jié)構(gòu)與功能損害中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BALB/C小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SYXK(渝)20120002。LC3B抗體、Beclin 1抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;全蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物;辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗為美國(guó)Southern Biotech公司產(chǎn)品;超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒由美國(guó)GE公司提供;蛋白測(cè)定試劑盒、小型垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜、蛋白印跡相關(guān)試劑及ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;H-600型透射電鏡購(gòu)自日本日立公司。

1.2 小鼠Ⅲ度燙傷模型的制作 選取6～8周齡的清潔級(jí)BALB/C小鼠24只，雌雄不拘，體重20～25g，飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將24只小鼠簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分成6組，每組4只，即燙傷前(正常對(duì)照)組、燙傷后1 h組、2 h組、6 h組、12 h組和24 h組。所有小鼠均用剃推剪和8%硫化鈉去除背部毛發(fā)。除燙傷前組外，其余5組的20只小鼠于90℃水浴鍋中燙傷已脫毛的背部皮膚10 s，造成30%TBSA的Ⅲ度燙傷(經(jīng)病理切片證實(shí))，傷后立即腹腔注射1 mL等滲鹽水，自由進(jìn)食水。取各組小鼠心、肝、肺、腎器官組織標(biāo)本，分別用2.5%戊二醛保存用于透射電鏡或液氮保存待用于蛋白表達(dá)分析。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.3.1 器官組織Beclin 1與LC3蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)Beclin 1與LC3蛋白表達(dá)，方法簡(jiǎn)述如下:用全蛋白提取試劑盒提取各器官組織全蛋白提取物，取上清用RC DC蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。所提取蛋白經(jīng)100℃水浴5 min后，進(jìn)行8%～12%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5%脫脂奶室溫封閉1 h，向PVDF膜滴加Beclin 1或LC3一抗(稀釋度為1∶1000)，以β肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參(稀釋度為1∶5000)。4℃孵育過(guò)夜后，用TBST洗膜4次，滴加經(jīng)1∶5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG或HRP-羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。用 TBST洗膜4次后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，經(jīng)ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)采集信號(hào)。Quantity One軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，LC3的相對(duì)表達(dá)量是以LC3Ⅰ與LC3Ⅱ的比值表示，Beclin 1的相對(duì)表達(dá)量是以其與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白的比值表示。

1.3.2 透射電鏡檢測(cè)自噬 器官組織用2.5%戊二醛(磷酸緩沖液配制，pH 7.2～7.4)于4℃固定2～4 h，0.1 mol/L 磷酸緩沖液漂洗(30 min/次 × 2次)，1%鋨酸4℃固定2 h。固定后的樣本經(jīng)丙酮梯度脫水后，用丙酮:環(huán)氧樹(shù)脂1∶1浸泡1h，在40℃烤箱中先后用純包埋劑和包埋劑分別處理2 h。最后用環(huán)氧樹(shù)脂618包埋半薄切片定位、超薄切片，鉛染色，置于電鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 燙傷后各器官組織自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和LC3表達(dá)的變化 與燙傷前組相比較，小鼠燙傷后1 h心、肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)均開(kāi)始逐漸增加，肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)于傷后12 h達(dá)高峰，隨后回落，但至傷后24 h時(shí)仍高于正常對(duì)照。心組織Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)則是持續(xù)性逐漸增加，至傷后24 h時(shí)仍顯著高于正常對(duì)照。見(jiàn)表1、表2。免疫印跡結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

表1 燙傷前后各器官組織Beclin 1蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表1 燙傷前后各器官組織Beclin 1蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

與燙傷前比較，*P ＜0.05

器 官不同時(shí)間Beclin 1 24 h心0.60 ±0.16 0.70 ±0.19 0.96 ±0.09* 1.02 ±0.06* 1.18 ±0.05* 1.68 ±0.54蛋白表達(dá)量燙傷前 燙傷后1 h 燙傷后2 h 燙傷后6 h 燙傷后12 h 燙傷后*肝0.65 ±0.20 0.95 ±0.11* 0.99 ±0.10* 1.21 ±0.13* 1.37 ±0.18* 0.81 ±0.23肺0.80 ±0.07 0.88 ±0.08 1.00 ±0.05* 1.10 ±0.07* 1.27 ±0.06* 1.00 ±0.17腎0.70 ±0.14 0.82 ±0.12 0.95 ±0.13* 1.16 ±0.12* 1.51 ±0.20*0.87 ±0.21

表2 燙傷前后各器官組織LC3蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表2 燙傷前后各器官組織LC3蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

與燙傷前比較，*P ＜0.05

器 官不同時(shí)間LC3 24 h心2.58 ±0.93 3.48 ±1.25 4.25 ±1.55* 4.38 ±1.69* 5.20 ±1.83* 6.08 ±2.04蛋白表達(dá)量燙傷前 燙傷后1 h 燙傷后2 h 燙傷后6 h 燙傷后12 h 燙傷后*肝0.91 ±0.24 1.24 ±0.52 1.35 ±0.43* 1.60 ±0.44* 2.03 ±0.57* 1.03 ±0.37肺0.87 ±0.29 1.12 ±0.27 1.20 ±0.33* 1.30 ±0.45* 1.66 ±0.59* 1.19 ±0.38腎0.68 ±0.21 1.05 ±0.41 1.39 ±0.57* 1.48 ±0.71* 2.12 ±0.75*1.01 ±0.17

圖1 燙傷前后各器官Beclin 1蛋白表達(dá)Figure 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

圖2 燙傷前后各器官LC3蛋白表達(dá)的變化Figure 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

2.2 透射電鏡變化 透射電鏡觀察是目前確定自噬的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)，為此我們利用透射電鏡觀察了燙傷前后心、肝、肺、腎組織細(xì)胞自噬的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。與燙傷前組相比較，燙傷后6 h時(shí)心、肝、肺、腎組織胞內(nèi)均出現(xiàn)自噬溶酶體增多，即細(xì)胞自噬增加。

圖3 燙傷前后各器官細(xì)胞自噬的變化Figure 3 Autophagy in the internal organs of the mice before and after scald

3 討 論

眾所周知，嚴(yán)重?zé)齻缙诘牟±砩碜兓瘶O其復(fù)雜，常常發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)、休克、缺血缺氧性損害、炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、高代謝反應(yīng)等病理生理反應(yīng)，而且這些病理生理反應(yīng)又常交替并相互影響，最終導(dǎo)致各器官結(jié)構(gòu)與功能受損，嚴(yán)重時(shí)常發(fā)生多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。有研究資料表明［7-9］，嚴(yán)重?zé)齻驧ODS的發(fā)生率高達(dá)28.1%，一旦發(fā)生極難逆轉(zhuǎn)，病死率達(dá)78%～98%。雖然近年來(lái)燒傷綜合救治水平在不斷提高，但嚴(yán)重?zé)齻驧ODS的防治仍然是當(dāng)前燒傷臨床所面臨的一道難題。究其根本原因，可能主要與對(duì)嚴(yán)重?zé)齻笃鞴俳M織結(jié)構(gòu)與功能損害的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚有關(guān)。

過(guò)去大量的研究表明［10-12］，燒傷可通過(guò)多種因素引起Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡即凋亡增加，且細(xì)胞凋亡在燒傷后器官組織結(jié)構(gòu)及功能損害或MODS的發(fā)生中具有重要作用。那么，同屬于程序性細(xì)胞死亡的Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡即自噬在嚴(yán)重?zé)齻笫欠褚舶l(fā)生變化呢?目前的研究尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察了小鼠嚴(yán)重燙傷早期心、肝、肺、腎實(shí)質(zhì)器官組織細(xì)胞自噬的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明:小鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度燙傷后，作為自噬重要標(biāo)記分子的Beclin 1及LC3在心、肝、肺、腎組織的蛋白表達(dá)于傷后1 h即開(kāi)始增加，且隨著傷后時(shí)間的延長(zhǎng)更進(jìn)一步增加，肝、肺、腎組織Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)于12h達(dá)高峰，隨后回落，但至24 h時(shí)仍高于傷前，心組織Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)更是持續(xù)性逐漸增加。既往的研究資料表明［13-14］，自噬的發(fā)生受到多種自噬相關(guān)基因的調(diào)控，其中Beclin 1與LC3在自噬小體的形成過(guò)程中均發(fā)揮著不可缺少的重要作用，它們表達(dá)水平的上調(diào)可以促進(jìn)自噬的發(fā)生，被認(rèn)為是自噬形成的標(biāo)志性分子。因此，小鼠嚴(yán)重燙傷后各器官組織Beclin 1與LC3蛋白表達(dá)水平升高，表明組織細(xì)胞自噬增加。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的透射電鏡結(jié)果也顯示嚴(yán)重燙傷小鼠心、肝、肺、腎組織自噬溶酶體增多，與上述的自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和LC3結(jié)果一致。綜合來(lái)看，小鼠嚴(yán)重燙傷后心、肝、肺、腎組織細(xì)胞自噬明顯增加。至于小鼠燙傷后24 h時(shí)心臟組織Beclin 1與 LC3表達(dá)持續(xù)上升，而肝、肺、腎組織Beclin 1與LC3表達(dá)則回落的原因，目前尚不清楚，推測(cè)可能與器官自身的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、缺血缺氧程度、信號(hào)通路、炎性細(xì)胞因子水平、活性氧產(chǎn)生不同等有關(guān)，但仍有待證實(shí)。

嚴(yán)重?zé)齻笃鞴俳M織自噬增加的意義目前尚難以確定。過(guò)去的研究認(rèn)為［15-17］，自噬在細(xì)胞存活與死亡中是把雙刃劍，對(duì)細(xì)胞的存活和死亡都有作用。適度自噬是細(xì)胞進(jìn)行自身代謝和細(xì)胞器更新的一種重要方式，利于細(xì)胞存活，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及調(diào)控細(xì)胞損傷有重要意義;但過(guò)度自噬則會(huì)引起細(xì)胞過(guò)多死亡，從而引起組織器官損害。最近有研究資料表明［18］，SD大鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度燙傷后的12 h內(nèi)心肌細(xì)胞自噬顯著增強(qiáng)，從而使心肌細(xì)胞過(guò)度死亡，導(dǎo)致心功能降低，而抑制自噬可減輕心功能損害。這一研究資料提示，嚴(yán)重?zé)齻鸬男募〖?xì)胞自噬活動(dòng)增強(qiáng)可能是燒傷后心肌損害與心功能降低的重要原因之一。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的小鼠嚴(yán)重燙傷后心、肝、肺、腎組織細(xì)胞自噬增加是否也與各器官組織結(jié)構(gòu)及功能損害有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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