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    膀胱尿路上皮癌中巨噬細胞移動抑制因子表達的臨床意義

    2014-11-30 09:08:12馮留偉李鐵強侯俊清
    中國醫(yī)藥生物技術 2014年1期
    關鍵詞:百分率尿路生存期

    馮留偉,李鐵強,侯俊清

    巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種廣泛表達的細胞因子,其生物學功能多樣,包括先天性與獲得性免疫反應中的促炎作用、抑制糖皮質激素、調節(jié) NK 細胞免疫功能、參與細胞增殖與生存、細胞遷移、DNA損傷和細胞周期調控等[1];MIF 在急性和慢性炎癥病理過程中也發(fā)揮著重要作用,如感染性休克、風濕性關節(jié)炎和動脈粥樣硬化等。此外,大量研究證實 MIF 在多種腫瘤中高表達,而與其緊鄰的非癌細胞中 MIF 表達無明顯增加[2]。但 MIF 與膀胱尿路上皮癌之間關系的報道甚少。本研究采用免疫組織化學法和 Western bolt 方法,分析 MIF 在膀胱尿路上皮癌中的表達特征及臨床意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 膀胱癌標本 來源于河南大學淮河醫(yī)院2006年泌尿外科手術病例 75 例(隨訪至術后5年),均經(jīng)組織病理學檢查,確診為膀胱尿路上皮癌,切緣組織中未見癌組織浸潤,術前均未經(jīng)任何治療。其中包括 50 名男性,25 名女性,年齡范圍 39~84 歲,平均年齡(66.8 ± 5.3)歲。組織離體后立即放置 –86 ℃ 冰箱中低溫保存。

    1.1.2 主要試劑 免疫組化 ABC 試劑盒為美國Vector Laboratories 公司產(chǎn)品;兔抗 MIF多克隆抗體為美國 Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品;生物素標記山羊抗兔二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自中衫金橋公司;PVDF 為美國 Millipore公司產(chǎn)品;ECL購自康為世紀生物科技有限公司。

    1.1.3 主要儀器 Power PACTMHC 型電泳儀及Trans-Blot SD?cell 電轉系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品;顯微鏡及 TS100 成像系統(tǒng)為日本 Nikon 公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組織化學 膀胱尿路上皮癌及癌旁組織經(jīng) 10% 多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片,切片厚度 4~5 μm。石蠟切片于 70 ℃ 烤箱烘烤30 min、二甲苯脫蠟 10 min、過梯度酒精(100%、90%、80%、70%),EDTA 法修復,2% 羊血清封閉 20 min。2% BSA 作為稀釋一抗(鼠源性單克隆抗 MIF 抗體,1∶100),4 ℃ 孵育過夜。生物素化二抗(羊抗鼠,1∶200)孵育 1 h。DAB 顯色 5 min、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。同時對照組的一抗用 PBS 代替。

    結果判定:MIF 蛋白以細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。首先根據(jù)全部組織中腫瘤細胞染色的陽性細胞所占總細胞的比例進行評分。在低倍視野下,陽性細胞所占比例小于 10% 為 0 分,10%~ 25% 為 1 分,25%~50% 為 2 分,50%~75%為 3 分,大于 75% 為 4 分。再根據(jù)免疫染色強度進行第二次評分,陰性為 0 分,弱陽性為 1 分,中度陽性為 2 分,強陽性為 3 分。最后將 2 次得到的評分相乘即為最終所得到的免疫組化評分,滿分為 12 分。

    1.2.2 Western blot 選取 TNM I~IV 期膀胱尿路上皮癌及手術切緣組織各 10 對,共 40 例。取200 mg 組織,按比例加入組織蛋白裂解液,冰上勻漿 10 min,于 4 ℃、12000×g 離心 5 min,吸取上清,置于 –80 ℃ 保存。用 BCA 法測定總蛋白濃度,在 15% SDS-PAGE 上電泳,蛋白上樣量為 50 μg。電泳完畢后使用電轉儀將樣品轉印至PVDF 膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h;以鼠源性單克隆抗 MIF 抗體(1∶5000)為一抗,室溫孵育2 h 或 4 ℃ 過夜。1×PBS 洗 3 次,每次 10 min,以山羊抗鼠 HRP-IgG(1∶2500)為二抗,室溫孵育1 h,ECL 顯色后暗室曝光,膠片掃描,圖像處理分析。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    將得到的免疫組化評分進行統(tǒng)計學分析。使用SPSS17.0 分析軟件,各組間的分析采用 t 檢驗,患者預后分析采用 Kaplan-Meier 曲線和 Log-rank檢驗分析,患者生存時間統(tǒng)計標準為手術時間開始到死亡時間或者統(tǒng)計終止時間,以 P ≤ 0.05 為有統(tǒng)計學差異。

    2 結果

    2.1 Western b1ot 結果

    40例膀胱鱗癌中,MIF 陽性表達的百分率為72.5%(29/40),部分 Western blot 結果如圖 1A 所示。在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中,MIF 高(過)表達的百分率分別為 50%(5/10)、70%(7/10)、80%(8/10)、90%(9/10),即隨著臨床分期的增加,其在膀胱尿路上皮癌組織中高表達比例逐漸增加(圖 1B)。與此相應,手術切緣組織中 MIF 的表達量亦逐漸降低。此外,經(jīng)統(tǒng)計學分析,TNM I 期 和 IV 期 MIF 陽性表達的差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。

    2.2 免疫組織化學法檢測結果

    圖1 Western blot 結果Figure1 Western blot result

    圖2 MIF 在膀胱正常上皮(A)、高分化癌(B)和低分化癌(C)中的表達情況Figure2 MIF expression in normal uroepithelial (A), well-differentiated uroepithelial cancer (B), poorly-differentiated uroepithelial cancer (C)

    表1 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌臨床病理資料的相關性Table1 Relationship between MIF expression and clinicopathological features of uroepithelial cancer in bladder

    MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達率是78.6%(59/75),著色主要位于細胞膜,如圖 2 所示。結果表明,MIF在高、中、低分化的膀胱尿路上皮癌中高(過)表達的百分率分別為 42%、52.8%、59.3%。分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌 TNM分期的相關性,發(fā)現(xiàn) MIF 在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中高(過)表達的百分率分別為60%、68%、73%、100%,且 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌的臨床分期有統(tǒng)計學意義(I 期 + II 期與III 期 + IV 期相比,P < 0.05)。MIF 在淋巴結轉移陽性和陰性的膀胱尿路上皮癌中高(過)表達的百分率分別為 66.7%、36.4%,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。然而,MIF 的表達與膀胱尿路上皮癌浸潤深度、性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大體類型無差異(表 1)。

    2.3 Kap1an-Meier 生存分析

    應用 Kaplan-Meier 生存分析法分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌患者生存時間的相關性。圖 3顯示 MIF 高表達的膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短(P = 0.0341),表明 MIF 的表達越高預示著患者生存時間越短,預后相對較差;相反,MIF表達較低的患者,其生存時間則較長。此外,Kaplan-Meier 生存分析法分析其他臨床資料與膀胱尿路上皮癌患者的生存關系,表明淋巴結轉移、TNM 分期與膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短呈正相關,而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤類型、浸潤深度與膀胱尿路上皮癌患者生存期無關。

    圖3 MIF 的表達情況與膀胱尿路上皮癌患者生存期的關系(P = 0.0341)Figure3 Correlation between MIF expression and patients with uroepithelial cancer of bladder (P = 0.0341)

    3 討論

    惡性腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的極其復雜的緩慢過程,多數(shù)惡性腫瘤患者確診時已發(fā)展至中晚期,治療措施及效果有限,是導致惡性腫瘤患者高死亡率的根本原因之一。早期診斷和治療能夠明顯提高惡性腫瘤患者的治愈率,降低死亡率,延長患者生存時間。因此,近年來的研究熱點之一是尋找惡性腫瘤早期診斷的生物標志物,以便早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、徹底治愈[3]。

    MIF 是一個分子量為 12.5 kD 的炎癥因子,在急性和慢性炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用,如感染性休克、風濕性關節(jié)炎和動脈粥樣硬化等[4]。除此之外,MIF 在多種癌癥中表達水平明顯升高,包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌和膠質瘤等[5]。不僅如此,MIF 的表達水平還與多種腫瘤患者的生存期密切相關,提示 MIF 可能與腫瘤的侵襲和轉移有關[6]。因此,MIF 可能是炎癥反應與腫瘤發(fā)生的紐帶,在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。利用 MIF 拮抗性抗體或基因沉默技術敲低 MIF 表達可導致細胞增殖減慢,抑制腫瘤生長和血管生成,間接影響腫瘤的生長和發(fā)展進程。Piette 等[7]報道,MIF 參與人肺腺癌細胞的侵襲與轉移。Rendon 等[4]和 Ren 等[8]研究報道,MIF 在膠質母細胞瘤和前列腺癌的生長和侵襲中也發(fā)揮著重要作用。

    本研究通過免疫組織化學法和 Western blot方法驗證了 MIF 在膀胱尿路上皮癌及邊緣組織中的表達規(guī)律,結果發(fā)現(xiàn):MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達百分率為 78.6%(59/75),而在正常尿路上皮中均無表達,且與患者臨床分期、淋巴結轉移正相關,與患者生存時間負相關。這表明,MIF可能是膀胱尿路上皮癌變多階段演進過程中的重要變化分子。

    膀胱尿路上皮癌惡性程度越高,腫瘤浸潤和轉移能力越強。本研究也表明,隨著膀胱尿路上皮癌惡性程度增加,MIF 在其中的表達量也顯著增加(P< 0.05)。因此,我們推測 MIF 可能是膀胱尿路上皮癌早期診斷和預后判斷的重要生物標志之一。

    [1] Morand EF, Leech M, Bernhagen J.MIF: a new cytokine link between rheumatoid arthritis and atherosclerosis.Nat Rev Drug Discov, 2006,5(5):399-410.

    [2] Honda A, Abe R, Makino T, et al.Interleukin-1beta and macrophage migration inhibitory factor (MIF) in dermal fibroblasts mediate UVA-induced matrix metalloproteinase-1 expression.J Dermatol Sci,2008, 49(1):63-72.

    [3] Hill OT, Mason TJ, Schwartz SW, et al.Improving prostate cancer detection in veterans through the development of a clinical decision rule for prostate biopsy.BMC Urol, 2013, 13:6.

    [4] Rendon BE, Roger T, Teneng I, et al.Regulation of human lung adenocarcinoma cell migration and invasion by macrophage migration inhibitory factor.J Biol Chem, 2007, 282(41):29910-29918.

    [5] Bucala R.MIF, MIF alleles, and prospects for therapeutic intervention in autoimmunity.J Clin Immunol, 2013, 33 Suppl 1:S72-S78.

    [6] Guo Y, Hou J, Luo Y, et al.Functional disruption of macrophage migration inhibitory factor (MIF) suppresses proliferation of human H460 lung cancer cells by caspase-dependent apoptosis.Cancer Cell Int, 2013, 13(1):28.

    [7] Piette C, Deprez M, Roger T, et al.The dexamethasone-induced inhibition of proliferation, migration, and invasion in glioma cell lines is antagonized by macrophage migration inhibitory factor (MIF) and can be enhanced by specific MIF inhibitors.J Biol Chem, 2009,284(47):32483-32492.

    [8] Ren Y, Chan HM, Fan J, et al.Inhibition of tumor growth and metastasis in vitro and in vivo by targeting macrophage migration inhibitory factor in human neuroblastoma.Oncogene, 2006, 25(25):3501-3508.

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