過表達(dá)Tribbles同源蛋白3促進成纖維細(xì)胞分泌I型膠原的研究

劉虹，謝瓊，李勇枝，薛春美，王靜，王佳平

Tribbles 同源基因 3（tribbles homolog 3，TRB3）是果蠅 tribbles 基因的哺乳動物同源基因，在嚙齒類動物中亦被稱為神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)假激酶（neuronal cell death-inducible putative kinase，NIPK）基因[1]。TRB3 蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能，在多條信號通路中充當(dāng)了限制性的角色，并且在胚胎發(fā)育和癌癥、自身免疫性疾病、糖尿病等人類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[2]。最新的研究表明，TRB3 與纖維化疾病密切相關(guān)：纖維化的主要病理改變是組織間膠原的過度沉積，Tang 等[3]發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，TRB3 可以差異性調(diào)節(jié)多種膠原的表達(dá)，可以增加 I 型膠原的含量，同時抑制 III 型膠原的表達(dá)。在纖維化發(fā)生的過程中，成纖維細(xì)胞是I 型膠原的主要生產(chǎn)者[4]，而目前并沒有關(guān)于TRB3 調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中膠原含量的報道。

腺病毒載體的外源基因裝載量大、表達(dá)外源基因效率高，可以感染多種組織或細(xì)胞，且容易制得高滴度病毒載體。腺病毒載體進入宿主細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，安全性高。因而，腺病毒載體是繼反轉(zhuǎn)錄病毒載體之后，應(yīng)用范圍最廣泛且最具前景的病毒載體。因此，本文中使用pAdEasy-1 腺病毒載體，構(gòu)建了過量表達(dá)小鼠TRB3 的腺病毒系統(tǒng)。

在本研究中，我們使用腺病毒系統(tǒng)在小鼠成纖維細(xì)胞中過量表達(dá) TRB3，檢測成纖維細(xì)胞中 I 型膠原及 III 型膠原的含量，發(fā)現(xiàn) TRB3 的表達(dá)可以差異性地調(diào)節(jié) I 型膠原與 III 型膠原的含量。這一結(jié)果為闡明纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展提供了一定的指導(dǎo)意義，為治療纖維化疾病提供了新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞 3T3-NIH 細(xì)胞及 HEK293 細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心。3T3-NIH 細(xì)胞使用 DMEM 培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)。HEK293 細(xì)胞使用 IMDM 培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)。每隔 2 天傳代一次，細(xì)胞培養(yǎng)條件為 37 ℃，5% CO2。

1.1.2 主要試劑 DMEM、IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基、進口血清 FBS 和胰酶購于美國 Gibco 公司；pEASY- T1 simple 載體、TransScript 反轉(zhuǎn)錄酶和高保真 DNA 合成酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、Pme I、Pac I 限制性內(nèi)切酶購于美國 NEB 公司；Trizol、Lipofectine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購于美國 Invitrogen 公司；pADEasy-1 腺病毒表達(dá)系統(tǒng)購于德國 Merck 公司；小量腺病毒純化提取試劑盒購于德國 Biomega 公司；天狼猩紅染色試劑盒購于英國 Biocolor 公司；抗小鼠TRB3 購于美國 Sigma-Aldrich 公司，抗小鼠β-actin 抗體購自美國 Cell-Signaling Technology公司；I、III 型膠原抗體購于英國 Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒購于碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 TRB3 目的基因的克隆 針對小鼠 TRB3基因序列（NM_175093.2）設(shè)計引物，第一輪引物為 5' AGGACAAGATGCGAGCTAC 3'，5' CTGTTC ACAGCACCTAGAGC 3'。提取小鼠肝臟的 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA 作為模板，進行 PCR，退火溫度為 57 ℃，延長時間為 1 min，40 個循環(huán)。以第一輪測序正確的 PCR 產(chǎn)物為模板，進行第二輪PCR，添加酶切位點。選擇 Sal I、Hind III 為酶切位點，進行第二輪 PCR，5' ACGCGTCGACGACAA GATGCGAGCTACAC 3'，5' CCCAAGCTTCTAGCC GTACAGCCCC 3'，退火溫度為 58 ℃，延長時間為1 min，40 個循環(huán)。將 PCR 產(chǎn)物進行膠回收后，連接至 pEASY- T1 simple 載體，進行測序。

1.2.2 TRB3 腺病毒的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將測序正確的 TRB3 序列連接至 pTrack-CMV質(zhì)粒中，然后使用 Pme I 限制性內(nèi)切酶對其進行線性化，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌 BJ5183 中進行同源重組。在 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，選擇較小的克隆搖菌提取質(zhì)粒，使用 Pme I 內(nèi)切酶進行酶切鑒定，選擇鑒定正確的陽性重組子進行后續(xù)實驗。

1.2.3 TRB3 腺病毒的包裝 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將重組質(zhì)粒使用 Pac I 限制性內(nèi)切酶進行線性化后，轉(zhuǎn)染進 HEK293 細(xì)胞中進行腺病毒的包裝。培養(yǎng) 24 h 后換液，培養(yǎng)皿中可見到約 10% 的熒光，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后可見到“彗星”樣熒光，第7 天補加 3 ml 培養(yǎng)基，到第 12 天細(xì)胞有 80%脫落時，去除培養(yǎng)上清，加入 3 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基收集細(xì)胞。

1.2.4 TRB3 腺病毒的擴增 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將細(xì)胞置于 37 ℃ 5 min 后，置于 –80 ℃ 5 min，反復(fù)凍融 3 次，1140×g、4 ℃ 離心 5 min，棄去細(xì)胞碎片，將上清使用 0.22 μm 的濾器過濾，將1 ml 凍融液加入到細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，進行新一輪的病毒擴增。72 h 后，待細(xì)胞有 80% 脫落時，收集細(xì)胞，將其置于 37 ℃ 5 min 后，置于 –80 ℃5 min 條件下，反復(fù)凍融 3 次。繼續(xù)下一輪的擴增。反復(fù) 5 輪擴增之后，收集所有的病毒凍融液進行純化。

1.2.5 TRB3 腺病毒純化 按照說明書的操作步驟，使用小量腺病毒純化提取試劑盒進行純化，將凍融的混合物 1140×g、4 ℃ 離心 10 min，取上清，用 0.45 μm 濾膜過濾。將過濾的病毒上清液加入到平衡好的硅膠純化柱中，柱子垂直插入冰盒，依靠重力使上清液通過純化柱。再加入 5 ml 漂洗緩沖液洗滌純化柱兩次，向柱子中加入 5 ml 平衡緩沖液。洗脫后將洗脫液裝入處理好的透析袋中，放入滅菌預(yù)冷的 PBS（pH 7.4）中，4 ℃ 低溫室透析 8～10 h，中間更換 PBS 一次；使用 0.22 μm 的濾器過濾透析后的病毒液，取 50 μl 用于測定滴度，其余病毒放入 –80 ℃ 保存。

1.2.6 TRB3 腺病毒滴度測定 以 TCID50法在96 孔板中測定腺病毒的滴度。將 HEK293 細(xì)胞消化計數(shù)，每孔種 5×103個細(xì)胞以及 150 μl 的10% FBS 培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿 90% 以上，更換新的 10% FBS 培養(yǎng)基，每孔加入使用培養(yǎng)基梯度稀釋的病毒液，梯度設(shè)置如下：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，每個梯度設(shè)置 5 個孔，另設(shè)一排細(xì)胞不加病毒作為對照，培養(yǎng) 5 d 后觀察熒光。以觀察該孔是否有熒光為主，是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)為輔，有熒光反應(yīng)及有細(xì)胞病變的孔確定為陽性孔，最后按照Reed-Muench method 公式計算病毒滴度。

1.2.7 Western blot 取適量培養(yǎng)細(xì)胞，加入 RIPA裂解液后振蕩混勻，冰上放置 30 min，間或振蕩；4 ℃、4560×g，離心 15 min。取上清，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，其具體步驟參照說明書進行。調(diào)節(jié)蛋白至相同濃度，分裝，加入 5 倍上樣緩沖液，96 ℃ 變性 10 min，一部分用于 SDS 電泳，一部分 –80 ℃ 保存[6]；使用 Amersham 顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng) Western blot 印跡分析軟件測出各條帶的光密度值并分析[7]。

1.2.8 天狼猩紅染色檢測 I 型膠原 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的方法，收集細(xì)胞后，4 ℃、600×g 離心20 min 后取上清，按照膠原檢測試劑盒說明書檢測膠原含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRB3 目的基因克隆及載體構(gòu)建

以小鼠肝臟為模板，進行 PCR 克隆 TRB3 基因序列，將 PCR 產(chǎn)物進行 DNA 瓊脂糖凝膠電泳，得到 1200 bp 左右的條帶，符合 TRB3 目的基因的大?。▓D 1A），經(jīng)測序鑒定得到序列正確的質(zhì)粒。使用雙酶切，將得到的 TRB3 目的片段插入到 pTrack-CMV 的多克隆位點中，得到含有 TRB3目的片段的載體 TRB3-CMV，將其與空載體pTrack-CMV 共同進行 DNA 瓊脂糖凝膠電泳，TRB3-CMV 的分子量大于空載體（圖 1B），說明TRB3-CMV 構(gòu)建成功。

圖1 TRB3 電泳結(jié)果（A：TRB3 基因 PCR 結(jié)果；B：TRB3-CMV 電泳結(jié)果）Figure1 The electrophoresis results of TRB3 (A: PCR results of TRB3; B: Electrophoresis results of TRB3-CMV)

2.2 TRB3 腺病毒的包裝

將重組后的、帶有 TRB3 目的基因的腺病毒載體（Ad-TRB3）使用 Pac I 限制性內(nèi)切酶進行線性化，將線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進 HEK293 細(xì)胞中，于 37 ℃細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，進行病毒顆粒的包裝，當(dāng)病毒包裝完畢后可以見到少量的綠色熒光（圖 2A）。

2.3 TRB3 腺病毒的滴度測定

圖2 轉(zhuǎn)染過表達(dá) TRB3 腺病毒質(zhì)粒的倒置熒光圖片（A：轉(zhuǎn)染后 24 h；B：轉(zhuǎn)染后 72 h）Figure2 The inverted fluorescence photo of overexpressed TRB3 adenovirus (A: Infecting for 24 h; B: Infecting for 72 h)

使用小量腺病毒純化提取試劑盒對擴增后的病毒進行純化并測定腺病毒的滴度，按照 Reed-Muench method 公式計算病毒滴度，計算結(jié)果為107.625TCID50/ml（表 1）。將純化完畢的病毒再次感染 HEK293 細(xì)胞后，觀察綠色熒光的表達(dá)，此時綠色熒光明顯增多，表明腺病毒滴度增加（圖 2B）。

2.4 鑒定 TRB3 腺病毒的表達(dá)效果

將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒感染 HEK293細(xì)胞后，使用 PCR 的方法檢測 TRB3 的表達(dá)，結(jié)果顯示，TRB3 的 mRNA 水平要明顯高于正常HEK293 細(xì)胞以及感染對照載體 Ad-Track 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞（圖 3A）。將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒感染 HEK293 細(xì)胞后，使用 Western blot 的方法檢測 TRB3 的表達(dá)，結(jié)果顯示感染Ad-TRB3 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞中，TRB3 的蛋白表達(dá)水平要明顯高于正常 HEK293 細(xì)胞及感染對照載體 Ad-Track 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞（圖3B），以上的實驗結(jié)果說明使用 Ad-TRB3 可以過量地表達(dá) TRB3。

2.5 過量表達(dá) TRB3 促進 3T3-NIH 細(xì)胞中膠原的分泌和表達(dá)

將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒 Ad-TRB3感染小鼠成纖維細(xì)胞 3T3-NIH 細(xì)胞后，使用天狼猩紅染色的方法檢測 3T3-NIH 細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量，結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量顯著增加，說明過量表達(dá) TRB3 可以顯著地促進成纖維細(xì)胞分泌膠原（圖 4A）。Western blot 法檢測TRB3 以及 I 型膠原的表達(dá)，結(jié)果顯示在感染過量表達(dá) TRB3 的腺病毒后，TRB3 的表達(dá)顯著增加，同時 I 型膠原的表達(dá)顯著增加，III 型膠原的表達(dá)顯著下降（圖 4B）。以上的實驗結(jié)果說明，過量表達(dá) TRB3 可以增加成纖維細(xì)胞中 I 型膠原的分泌和表達(dá)，同時降低 III 型膠原的表達(dá)。

表1 按照 Reed-Muench method 公式計算病毒滴度Table1 Calculating the virus drops according to the formula of Reed - Muench method

圖3 使用腺病毒載體過量表達(dá) TRB3（A：PCR 檢測 TRB3 mRNA 水平；B：Western blot 檢測 TRB3 蛋白水平）Figure3 The expression of TRB3 is increased in the HEK293 cells infected the adenovirus (A: Detecting the mRNA of TRB3 by PCR; B: Detecting the expression of TRB3 by Western blot)

3 討論

TRB3 是哺乳動物 Tribbles 家族三個成員（TRB1、TRB2、TRB3）中研究得最為清楚的一個，TRB3 在 PI3/Akt、BMP、MAPK 和 ATF4/CHOP通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控中起到了重要的作用[2]。在糖尿病性心肌病中，AGEs 可以誘導(dǎo) I 型膠原的產(chǎn)生，抑制 III 型膠原的產(chǎn)生，同時誘導(dǎo) TRB3 的表達(dá)增加；此外，當(dāng)抑制 ERK 和 p38-MAPK 后，再給予 AGEs 的刺激，I 型膠原表達(dá)下降，而 III型膠原表達(dá)升高；當(dāng)使用 siRNA 抑制 TRB3 的表達(dá)后，給予 AGEs 的刺激可以使 I 型膠原表達(dá)下降，而 III 型膠原表達(dá)升高[3]。因此，在糖尿病性心肌病中，TRB3/MAPK 信號通路調(diào)節(jié)了 I 型和III 型膠原的產(chǎn)生。以上的研究說明，TRB3 可以通過調(diào)節(jié)膠原的含量，參與組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。而我們的實驗結(jié)果顯示，增加 TRB3 的表達(dá)可以促進成纖維細(xì)胞中 I 型膠原的表達(dá)和分泌，降低 III 型膠原的含量，進一步支持了以上的研究結(jié)果。

腺病毒載體理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，能很容易獲得高滴度病毒系，可達(dá) 1011～1012pfu/ml，比反轉(zhuǎn)錄病毒高 104倍[8]。同時，腺病毒感染率高，既能感染復(fù)制狀態(tài)的細(xì)胞，又能感染非復(fù)制狀態(tài)的細(xì)胞[9]，復(fù)制缺陷型腺病毒是目前感染率最高的病毒，質(zhì)粒和反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染率都遠(yuǎn)低于 0.1%，腺病毒體外血管內(nèi)皮細(xì)胞感染效率達(dá) 100%，體內(nèi)感染率可達(dá) 15%～80%，以相同外源基因為基準(zhǔn)，腺病毒的感染效率是質(zhì)粒的 140000 倍[10]。且腺病毒載體可以容納較大的外源性 DNA 片段（8 kb 左右）[11]，腺病毒載體的細(xì)胞毒性較低，應(yīng)用比較安全[12]。因此，在本研究中構(gòu)建了過量表達(dá) TRB3 的腺病毒載體，并且在小鼠成纖維細(xì)胞系 3T3-NIH 中，探討過量表達(dá) TRB3 后對于成纖維細(xì)胞分泌膠原的影響。

圖4 過量表達(dá) TRB3促進 3T3-NIH細(xì)胞 I 型膠原的分泌（A：天狼猩紅染色法檢測膠原含量；B：Western blot 法檢測TRB3、I 型膠原及 III 型膠原的表達(dá)）Figure4 Overexpression of TRB3 could promote the secretion of type I collagen in mouse fibroblasts cell (A: Detecting the collagen by Sirius red staining; B: Detecting the expression of TRB3, collagen I and collagen III by Western blot)

我們在研究中將小鼠 TRB3 基因插入腺病毒載體穿梭質(zhì)粒的 E1 區(qū)中，構(gòu)建了攜帶小鼠 TRB3基因的重組腺病毒 Ad-TRB3，采用兩個相同效率的啟動子分別啟動 TRB3 和 GFP 兩個基因，從而使得 TRB3 和 GFP 兩個外源蛋白同比例地高效表達(dá)，從而合成具有高效生物活性的 TRB3。而且該重組腺病毒不僅 E1 基因缺失，而且 E3 基因也缺失，使得其毒性更加降低，因而使用時更加安全可靠。本實驗通過 PCR、Western blot 等分子生物學(xué)技術(shù)檢測，均證明構(gòu)建的 Ad-TRB3 是能夠高效表達(dá) TRB3 的，并具有很高的病毒滴度。

綜上所述，使用腺病毒系統(tǒng)在小鼠成纖維細(xì)胞中過量表達(dá) TRB3 可以促進 I 型膠原的表達(dá)與分泌，降低 III 型膠原的表達(dá)，說明 TRB3 可以差異性調(diào)節(jié)膠原的含量。這一研究結(jié)果為探討 TRB3促進纖維化發(fā)生提供了新的研究方向，進一步明確了 TRB3 可以作為治療纖維化疾病發(fā)生的潛在靶點。

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