枯草芽孢桿菌孢子懸液保藏期的驗證

肖璜，林吉恒，馬仕洪，胡昌勤

藥品微生物檢驗是評價藥品質(zhì)量的重要手段之一?！吨袊幍洹?005年版增加了對藥品進行無菌檢查和微生物限度檢查時需進行方法學驗證和對培養(yǎng)基進行靈敏度檢測的要求，通過檢測實驗菌株在試驗系統(tǒng)中生長能力，判斷實驗體系的適用性。在上述檢測過程中，標準實驗菌株的純度、生物學特性的變異都會影響檢驗結(jié)果。因此，在藥品微生物實驗室中，如何評估保藏菌株在使用過程中的死亡、衰退和變異，保持實驗菌株的原有生物學特征等問題就變的尤為重要[1]。對藥品微生物實驗室中標準菌種保藏的研究分為兩個方向[2]：一是為基層單位尋找簡單、實用和經(jīng)濟的方法；二是為科研機構(gòu)尋找能確保長期穩(wěn)定保藏的方法。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是藥品微生物實驗室最常用的標準菌株之一?？莶菅挎邨U菌處于孢子體時其代謝呈最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，有利于長期保存，如能利用枯草芽孢桿菌孢子體作為保藏菌種，將方便檢驗過程?，F(xiàn)行的《中國藥典》（2010年版）對于菌液的要求：若在室溫下放置，應在 2 h 內(nèi)使用；若保存在 2～8 ℃，可在 24 h 內(nèi)使用；黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8 ℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用?！睹绹幍洹?6 版（USP36）中指出，枯草芽孢桿菌及黑曲霉的穩(wěn)定孢子懸液均可在驗證過的貯存期內(nèi)保存并直接稀釋使用。由此可見，枯草芽孢桿菌孢子懸液作為枯草芽孢桿菌的保藏形式其穩(wěn)定性是得到肯定的。但在兩國藥典中，對于貯存期并未做過多描述。

本文以枯草芽孢桿菌孢子體為研究對象，基于使用的便利性和應用過程中的可靠性，設(shè)計了計數(shù)實驗及藥敏實驗，考察枯草芽孢桿菌孢子體在蒸餾水保存法中保藏的貯存期，為檢驗過程中的便利使用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Ⅱ 級 A2 型生物安全柜為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；RD115 型恒溫培養(yǎng)箱為德國 Binder 公司產(chǎn)品；BT2202S型電子天平為賽多利斯公司產(chǎn)品；MLS-3780 型滅菌器為SANYO 公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自北京三藥公司；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]購自中國食品藥品檢定研究院，使用其二代菌株；鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液（0.4 g/250 ml）購自方正醫(yī)藥研究院有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 枯草芽孢桿菌接種至營養(yǎng)瓊脂克氏瓶中，35 ℃ 培養(yǎng) 7 d；用含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水吹洗振蕩，制成高濃度孢子菌懸液。用含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水稀釋原始菌液，分裝于滅菌后的菌種凍存管（1 ml/管）中。將上述菌種凍存管分成兩組，一組放置在室溫（25 ℃）中保藏，另一組放置在冰箱（4 ℃）中保藏?？疾旖?jīng) 65 ℃ 加熱 30 min 滅活前后的原始菌液計數(shù)結(jié)果。

1.2.2 實驗計數(shù) 采用營養(yǎng)瓊脂進行計數(shù)。分別于固定時間間隔（0 個月、1 個月、2 個月、3 個月）取不同保藏條件的 5 株菌進行梯度稀釋，每株計數(shù)三皿，于 35 ℃ 培養(yǎng)24 h 后進行計數(shù)。

1.2.3 藥敏試驗 參考 CLSI/NCCLS 推薦的微量稀釋法，分別于固定時間間隔（0 個月、1 個月、2 個月、3 個月）進行藥敏實驗。取 96 孔微量反應板，每孔分別加入180 μl 胰蛋白胨大豆肉湯；首樣品組加入鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液 20 μl，混勻；隨后各樣品組取前一樣品組中的20 μl 混合液，混勻；共設(shè) 10 個樣品組。最后每孔加孢子懸液 20 μl。設(shè)不加試藥的細菌對照組和無細菌的空白對照組，在 25 ℃ 培養(yǎng) 2 d 后觀察其 MIC 濃度。每個保存條件重復試驗 4 次。

2 結(jié)果

2.1 菌液制備

保存在含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水中的枯草芽孢桿菌孢子懸液，經(jīng) 65 ℃ 加熱 30 min 滅活后原始菌液計數(shù)結(jié)果未見顯著性降低（表 1）?！吨袊幍洹罚?010年版）抗生素微生物檢定法附錄下規(guī)定，用滅菌水洗下枯草芽孢桿菌的芽孢后，要在 65 ℃ 加熱 30 min，通過熱損傷殺死枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)體。由于表 1 中加熱前后的菌落計數(shù)未見顯著性降低，提示此步驟在對枯草芽孢桿菌孢子體的吐溫-蒸餾水保藏法中可能并非必需。

2.2 實驗計數(shù)

藥品微生物實驗室中，枯草芽孢桿菌的常用保存方法為斜面低溫保存法和菌懸液冷凍保存法。文獻[3]報道使用營養(yǎng)瓊脂斜面低溫（4 ℃）保藏可達 5年時間，使用營養(yǎng)肉湯超低溫（–20 ℃）保藏可達 4年時間。兩種方法操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備。但培養(yǎng)基在傳代過程中物理、化學特性的變化造成菌體代謝的改變，進而易誘導菌株的變異[4]。已有枯草芽孢桿菌因傳代次數(shù)過多易變成光滑型菌株影響抗生素效價測定的文獻報道[3]。同時，屢次傳代污染雜菌的機會增多。另外，基層實驗室中超低溫冰箱的配備并不普及。為克服上述不利因素，本研究中實驗溫度僅考慮了25 ℃ 和 4 ℃。同時，計數(shù)以及藥敏實驗環(huán)節(jié)均采用直接稀釋的方法，以避免多次傳代的影響。

表1 滅活前后原始菌液計數(shù)結(jié)果

保存在含 0.05% 吐溫的滅菌蒸餾水中的枯草芽孢桿菌孢子懸液，在不同保藏溫度（25 ℃ 和 4 ℃）條件下，菌數(shù)相對穩(wěn)定（圖 1）?？紤]到數(shù)據(jù)統(tǒng)計的便利性，將以上結(jié)果經(jīng)求對數(shù)做方差分析，結(jié)果見表 2。經(jīng)方差分析，25 ℃（室溫）及 4 ℃（低溫）兩種保存條件下菌數(shù)在考察時間內(nèi)出現(xiàn)增長的趨勢。同時，經(jīng)兩兩比較，兩種保存條件下，第 2、3 個月顯著高于第 0、1 個月的結(jié)果（P < 0.01），而第 0、1 個月之間和第 2、3 個月之間沒有顯著性差異，說明兩種保存條件下，1 個月內(nèi)菌落計數(shù)無顯著性差異。

2.3 藥敏試驗

將兩種保存條件的枯草芽孢桿菌孢子懸液做藥敏實驗，結(jié)果見表 3。25 ℃（室溫）及 4 ℃（低溫）兩種保存條件下的枯草芽孢桿菌孢子懸液在第一個月內(nèi)其藥敏結(jié)果不變，而在 2、3 個月內(nèi)結(jié)果發(fā)生變化。

3 討論

文獻報道枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體菌體脆弱，在室溫及低溫條件下第 2 天即大量死亡，在室溫與低溫中衰退較快[5]。當枯草芽孢桿菌處于孢子體時其代謝呈最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，有利于長期保存。因此本次實驗中，我們考察了相對靜止狀態(tài)的孢子體的穩(wěn)定性，在 3 個月的保藏過程中，菌液不僅存活率未見衰退，在室溫與低溫兩種實驗條件下都出現(xiàn)了增長的趨勢，結(jié)果令人滿意。由于藥品微生物實驗室工作菌株在應用中主要采用梯度稀釋法，因此，原始菌液的濃度是十分重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。本次實驗通過計數(shù)實驗探索貯存期內(nèi)孢子懸液濃度的變化。結(jié)果顯示：25 ℃（室溫）及4 ℃（低溫）兩種保存條件下菌數(shù)在考察期內(nèi)出現(xiàn)趨勢性增長。兩種保存條件下，1 個月內(nèi)菌落計數(shù)無顯著性差異。

菌種在貯存期內(nèi)是否存在退行性變異也是需要考慮的問題?；谒幤肺⑸餀z驗中通常利用枯草芽孢桿菌進行適用性實驗，通過檢測系統(tǒng)最終是否抑制試驗菌株的生長，判斷體系的實用性的目的，我們設(shè)計了藥敏試驗，通過分析枯草芽孢桿菌對抑菌成分的敏感性，表征其生物學特性是否發(fā)生變異。CLSI/NCCLS 推薦的培養(yǎng)條件為 CAMHB（調(diào)節(jié)了鈣鎂離子濃度的 MH 肉湯）、35 ℃；而在《美國藥典》無菌檢查章節(jié)中，枯草芽孢桿菌可在 25 ℃ 使用胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)觀察；基于使用目的，我們參照《美國藥典》確定了藥敏實驗條件。實驗表明，兩種保存條件1 個月貯存期內(nèi)，枯草芽孢桿菌孢子體的藥物敏感性未出現(xiàn)變化，但貯存期超過 1 個月后，藥物敏感性發(fā)生變化，不宜再作為方法驗證的標準菌株使用。

圖1 不同儲存溫度的菌液計數(shù)結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

表3 藥敏實驗結(jié)果（μg/ml）

枯草芽孢桿菌以孢子懸液的形式進行保存，具有簡單、使用方便等優(yōu)點。貯存期驗證表明，在 25 ℃（室溫）及4 ℃（低溫）兩種保存條件下，枯草芽孢桿菌孢子懸液 1 個月內(nèi)計數(shù)與藥敏結(jié)果均穩(wěn)定，可直接稀釋使用。

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