癲疒間伴發(fā)抑郁大鼠模型建立及評(píng)價(jià)

楊 萍，李 亮*，孫美珍

（1.湖南省第二人民醫(yī)院精神科，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長(zhǎng)沙410208；3.山西醫(yī)科大學(xué)附一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原030001）

癲疒間與抑郁共存被認(rèn)為是一種常見的神經(jīng)精神病學(xué)現(xiàn)象[1]。我們前期對(duì)鋰-匹羅卡品癲疒間大鼠進(jìn)行抑郁篩選，挑選出伴發(fā)抑郁的大鼠，作為癲疒間伴發(fā)抑郁（epilepsy with depression，EWD）復(fù)合模型進(jìn)行進(jìn)一步研究，成功率僅約25%，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高而且資源頗為浪費(fèi)[2]。 在此基礎(chǔ)上我們改良了造模方法，將傳統(tǒng)的“鋰-匹羅卡品癲疒間造?！迸c“慢性溫和應(yīng)激刺激（chronic mild stress，CMS）抑郁造?！边M(jìn)行聯(lián)合，制備EWD 復(fù)合模型，并對(duì)此模型的建立和有效性做了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。 現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 成年雌性健康清潔級(jí)SD大鼠（動(dòng)物使用合格證號(hào)43004700005442），體質(zhì)量180～220 g， 由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SYXK(湘)2009-0001）。 標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。 其間訓(xùn)練飲用蔗糖水，測(cè)定蔗糖水消耗和曠場(chǎng)試驗(yàn)基線值。 之后選擇行為學(xué)評(píng)分相近大鼠，隨機(jī)分為4 組：正常組8 只、癲疒間組11只、CMS 組9 只、癲疒間+CMS 組10 只。 癲疒間組采用鋰-匹羅卡品進(jìn)行慢性癲疒間造模，CMS 組采用CMS進(jìn)行抑郁造模，癲疒間+CMS 組在進(jìn)行慢性癲疒間造模后再予以CMS 進(jìn)行聯(lián)合造模以制備EWD 大鼠模型。 最終32 只大鼠納入統(tǒng)計(jì)，每組8 只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 匹羅卡品（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)P1650000）；氯化鋰（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)62480）；5-HT1A 受體引物（武漢博士德公司合成）。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR 儀（西安天隆科技有限公司，TL988）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 癲疒間模型制備 將癲疒間組大鼠腹腔注射氯化鋰3 mEq/kg，18 h 后再給予匹羅卡品30 mg/kg，在注射匹羅卡品前20 min 注射阿托品1 mg/kg 以拮抗外周膽堿能作用。 正常組注射30 mg/kg 生理鹽水。 根據(jù)Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]，造模后出現(xiàn)癲疒間持續(xù)狀態(tài)40 min即給予地西泮4 mg/kg 和10%水合氯醛3 mL/kg，終止急性期癲疒間發(fā)作，Racine≥IV 級(jí)并存活者入組。 存活大鼠隨后出現(xiàn)不同程度的慢性疒間性發(fā)作（如抽搐、點(diǎn)頭等），表明造模成功。 造模持續(xù)4 周。

1.2.2 CMS 模型制備 將CMS 組大鼠按Willner方法[4]加以改進(jìn)制備抑郁模型，選擇以下9 種刺激每天隨機(jī)采取一種，共安排2 周。 （1）禁食、禁水20 h；（2）禁水17 h；（3）傾斜鼠籠（45 ℃）17 h；（4）濕籠（100 g 鋸屑?jí)|料中加入200 mL 水）21 h；（5）持續(xù)光照17 h；（6）電擊（30 V 電壓）足底5 s；（7）4℃冰水游泳（水深15 cm，大鼠的后足尖剛能觸及桶底）5 min；（8）夾尾1 min；（9）行為限制2 h。

1.2.3 EWD 模型制備 針對(duì)癲疒間+CMS 組大鼠，將以上兩種造模方法進(jìn)行聯(lián)合。 首先進(jìn)行癲疒間模型制備，造模4 周后進(jìn)行CMS 模型制備。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 抑郁行為學(xué)檢測(cè) 造模后第6 周進(jìn)行。 （1）糖水消耗試驗(yàn)：造模前訓(xùn)練大鼠適應(yīng)飲糖水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24 h，兩瓶均裝有1 %蔗糖水，隨后的24 h，一個(gè)瓶裝1%蔗糖水，另一個(gè)瓶裝純水。禁水24 h 后，進(jìn)行動(dòng)物的基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗(yàn)。 同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：1 瓶1%蔗糖水和1 瓶純水。 1 h 后，取兩瓶水稱量。 計(jì)算動(dòng)物的糖水消耗、糖水偏愛（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%）。 （2）曠場(chǎng)試驗(yàn)：由不透明材料制成的76 cm×76 cm×42 cm 正方形敞箱，底面等分為25個(gè)等邊方格；晨7：30～12：00 在安靜的房間內(nèi)觀察置于中心方格內(nèi)的大鼠5 min 內(nèi)垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)。 徹底清潔敞箱后進(jìn)行下一只大鼠的觀察。

1.3.2 5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 進(jìn)行抑郁行為學(xué)檢測(cè)后麻醉后處死動(dòng)物，取海馬齒狀回。 用Triziol 法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 構(gòu)建聚合酶體系（5-HT1A 受體的上游引物為5’-GCACCAGCTTAGGAACTTCG-3’， 下游引物為5’-CAGAGGAAGGTGCTCTTTGG-3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度206 bp；β-actin 的上游引物為5’-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’， 下游引物為5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度210 bp）；Taq 酶催化， 熱循環(huán)：95 ℃預(yù)熱5 min，40個(gè)循環(huán)(94 ℃20 s；退火20 s；72 ℃30 s)。 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法，將閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值擬合作圖， 得出校正曲線。 Ct值為mRNA 豐度定量標(biāo)準(zhǔn)，Ct 值越高， 代表mRNA豐度越低。 △△Ct=（實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct 值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct 值）-（正常組目的基因Ct 值-正常組內(nèi)參基因Ct 值）。 通過2-△△Ct法根據(jù)目的基因與內(nèi)參物（β-actin）Ct 值的比較，得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量，對(duì)5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行定量，以此進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

癲疒間組癲疒間造模成功9 只，造模第10 天癲疒間大發(fā)作死亡1 只；CMS 組造模第37 天死亡1 只；癲疒間+CMS 組造模第13 天癲疒間大發(fā)作死亡1 只，造模第42 天死亡1 只。癲疒間+CMS 組大鼠均出現(xiàn)不同程度癲疒間發(fā)作，且伴有體質(zhì)量、食欲下降、興趣喪失、活動(dòng)減少。

2.2 大鼠抑郁行為學(xué)比較

與正常組比較，癲疒間組大鼠的抑郁行為學(xué)指標(biāo)（糖水消耗、糖水偏愛、垂直及水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CMS 組各指標(biāo)降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癲疒間+CMS 組則降低得更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與癲疒間組比較，癲疒間+CMS組各指標(biāo)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CMS組比較，癲疒間+CMS 組的糖水偏愛程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠抑郁行為學(xué)變化 （n=8，±s）

表1 各組大鼠抑郁行為學(xué)變化 （n=8，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，☆☆P＜0.01；與癲疒間組比較△P＜0.05；與CMS 組比較◇P＜0.05。

組 別正常組癲疒間組CMS 組癲疒間+CMS 組糖水消耗試驗(yàn)糖水消耗（mL） 糖水偏愛（%）13.61±2.6 83.6±7.6 10.9±3.9 75.1±15.3 8.5±0.3* 64.9±9.4*7.6±2.8☆☆△ 55.1±13.7☆☆△◇曠場(chǎng)試驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)（次） 水平運(yùn)動(dòng)（次）21.6±2.1 58.2±13.1 17.4±4.4 49.2±17.5 5.3±1.6* 21.4±4.1*7.4±2.3☆☆△ 19.5±6.3☆☆△

2.3 大鼠5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)比較

與正常組比較，癲疒間組、CMS 組、癲疒間+CMS 組大鼠的5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癲疒間+CMS 組降低的更為明顯；與癲疒間組比較，癲疒間+CMS 組5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CMS 組比較，癲疒間+CMS 組5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表2、圖1。 圖1 為各造模大鼠5-HT1A 受體基因與內(nèi)參基因溶解擴(kuò)增曲線圖， 曲線呈下降趨勢(shì)，說明該指標(biāo)檢測(cè)特異性高。

表2 各組大鼠海馬中5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠海馬中5-HT1A 受體mRNA 表達(dá)比較（±s，n=8）

注：與正常組比較*P＜0.05；與CMS 組比較△P＜0.05。

組 別正常組癲疒間組CMS 組癲疒間+CMS 組5-HT1A Ct 值19.11±0.31 21.66±0.78 20.14±0.56 22.18±0.68內(nèi)參Ct 值16.67±0.45 17.57±0.15 15.32±0.78 16.55±0.56△△Ct 值1.23±0.03 4.29±0.89 3.56±0.57 4.75±0.79 2－△△Ct 1.12±0.87 0.08±0.03*0.13±0.08*0.05±0.02*△

圖1 各造模大鼠5-HT1A 受體基因熒光變化曲線圖

3 討論

我國(guó)癲疒間的患病率在3.6‰～7.0‰[5]，EWD 的發(fā)生率為23.1%，明顯高于普通人群的抑郁發(fā)生率，且抑郁的終身患病率達(dá)到13%[6]。由此可見，癲疒間與抑郁共病現(xiàn)象非常普遍。

單純針對(duì)癲疒間或者抑郁的科學(xué)研究非常多，動(dòng)物模型的制備亦比較成熟。 如氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲疒間模型已被廣泛用于動(dòng)物科研， 因?yàn)殇?匹羅卡品誘導(dǎo)的癲疒間發(fā)作形式很接近人類慢性顳葉癲疒間特征，可反復(fù)出現(xiàn)癲疒間自發(fā)性發(fā)作， 與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制更為接近[7]；抑郁模型的制備方法則有很多，包括CMS 模型、孤養(yǎng)或分養(yǎng)模型、獲得性無助和行為絕望、社會(huì)挫敗模型、大鼠嗅球切除等[8]。其中CMS 模型是目前最為公認(rèn)的經(jīng)典模型之一，廣泛應(yīng)用于內(nèi)源性抑郁障礙的病理生理機(jī)制和藥物作用機(jī)制研究。然而，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)于WED 的研究則報(bào)導(dǎo)甚少。

在我們的前期研究中，首先利用鋰-匹羅卡品制備癲疒間大鼠模型， 隨后在此基礎(chǔ)之上通過行為學(xué)檢測(cè)進(jìn)行抑郁篩選， 挑選出EWD 大鼠用于下一步研究，成功率低，費(fèi)用高，效果不理想。 由此引發(fā)我們嘗試制備EWD 大鼠模型的思考。 理想的EWD 大鼠模型要求既能兼顧EWD 的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，又能體現(xiàn)抑郁的核心臨床癥狀，這是深入研究EWD 發(fā)生機(jī)制的前提和關(guān)鍵。該模型強(qiáng)調(diào)與人類EWD 存在以下相似點(diǎn)：（1）臨床核心癥狀相似，包括持續(xù)體現(xiàn)興趣減退和快感低下、 活動(dòng)性明顯減少等抑郁最基本核心臨床癥狀學(xué)特征；（2）抗抑郁藥效應(yīng)。 EWD 的癥狀更接近原發(fā)性抑郁[9]，如我們前期使用匹羅卡品癲疒間造模1月后有一部分大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力下降， 興趣喪失，快感缺乏，侵犯攻擊能力下降的情況。 成熟的原發(fā)性抑郁模型制備方法能完全復(fù)制EWD 的抑郁癥狀，并為其模型建立提供相對(duì)確切的病因復(fù)制方法。EWD 模型亦應(yīng)具備病理生理學(xué)效度，即體現(xiàn)疾病病理生理學(xué)特征，包括癲疒間臨床基本病理生理特征、癲疒間社會(huì)心理應(yīng)激和／或生物學(xué)因素及其他相關(guān)危險(xiǎn)因素，包括癲疒間后不良生活事件如抽搐，社會(huì)支持缺失等應(yīng)激因素。 研究發(fā)現(xiàn)社會(huì)應(yīng)激可加重癲疒間小鼠的被動(dòng)躲避缺陷， 提示可將實(shí)驗(yàn)性癲疒間和應(yīng)激復(fù)合作為處理因素制備EWD 動(dòng)物模型。

因此該研究將“鋰-匹羅卡品”與“CMS”進(jìn)行聯(lián)合造模，最終發(fā)現(xiàn)癲疒間大鼠伴發(fā)抑郁的成功率可達(dá)到80%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前期研究中的25%。 在制模后6 周癲疒間組大鼠出現(xiàn)不同程度的癲疒間發(fā)作，但抑郁行為學(xué)與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CMS 組出現(xiàn)興趣減退，活動(dòng)性減退等情況，而癲疒間+CMS 組大鼠除出現(xiàn)癲疒間發(fā)作外，還出現(xiàn)抑郁行為學(xué)變化，即大鼠糖水?dāng)z入量明顯減少，表現(xiàn)出對(duì)食物獎(jiǎng)賞刺激的低敏感性，類似于抑郁癥患者的快感缺失。 大鼠曠場(chǎng)水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分減少， 反映動(dòng)物的活動(dòng)度降低；垂直運(yùn)動(dòng)減少， 反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度降低，說明癲疒間+CMS 組動(dòng)物表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)。

中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂仍是抑郁癥生物學(xué)發(fā)病機(jī)制中最重要的假說， 研究顯示，EWD 的發(fā)生與神經(jīng)遞質(zhì)缺乏有關(guān)，特別是5-HT1A受體[10]。 5-HT1A 受體表達(dá)下降，則EWD 發(fā)病率上升。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示“鋰-匹羅卡品” 聯(lián)合“CMS”所制備出的EWD 大鼠模型組與正常組比較， 大鼠腦海馬區(qū)5-HT1A 受體mRNA 水平下降，結(jié)合以上行為學(xué)上的改變，說明該動(dòng)物模型能有效的模擬EWD的發(fā)病狀態(tài)，提高造模成功率，大大降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，是EWD 比較理想的大鼠模型。

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