頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖遷移的影響

劉波，鄒偉，唐強，顏培宇

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是指在圍產(chǎn)期窒息缺氧等因素導(dǎo)致的腦部缺氧缺血性損害，而此類疾病的治療至今仍為世界性醫(yī)學(xué)難題。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)具有高度增殖和自我更新以維持自身數(shù)目恒定的能力[1]。目前大量實驗研究表明，腦缺氧缺血后，神經(jīng)再生和腦組織功能恢復(fù)的機制是由于內(nèi)源性NSCs的大量增殖、遷移和分化[2-4]。本研究通過觀察頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激干預(yù)對HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs增殖遷移的影響，探討其改善HIBD神經(jīng)功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7日齡Wistar大鼠120只，由上海斯萊克公司提供，雌雄不限，體質(zhì)量11～15 g。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(A組)、造模組(B組)、頭穴叢刺組(C組)、豐富環(huán)境刺激組(D組)和頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激組(E組)。每組24只，均選取3 d、7 d、14 d 3個時間點，每個時間點8只。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD動物模型。7日齡新生Wistar大鼠，吸入適量無水乙醚麻醉，暴露頸部[5]。局部碘伏消毒，做頸部正中切口，無菌分離左側(cè)頸總動脈，并用外科0號滅菌手術(shù)絲線行雙線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合傷口。手術(shù)結(jié)束后，將動物放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復(fù)120 min，置于自制有機玻璃缺氧箱中，保持37℃水浴恒溫，持續(xù)將體積濃度為8%氧氣和92%氮氣的混合氣體以0.5 L/min輸入缺氧箱中。術(shù)后出現(xiàn)平衡異常、不能翻身或夾尾左旋者視為造模成功，將其納入實驗。A組僅分離左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，也不予以缺氧處理。

1.3 干預(yù)方法

A組術(shù)后置于普通母鼠籠中飼養(yǎng)，不予任何治療。

B組術(shù)后另置普通母鼠籠中飼養(yǎng)，不予任何治療。

C組采用叢刺法，按照“大鼠穴位圖譜”[6]所示，取百會穴及百會左、右側(cè)各旁開1 mm處針刺。每穴快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針120 min，每天1次。

D組每天將幼鼠分離放入豐富環(huán)境(enriched environment,EE)籠[7]內(nèi)，EE籠為70×60×50 cm的大籠，籠內(nèi)放置各種質(zhì)感的砂紙、毛刷，有刺激性氣味的薄荷、檸檬和冰冷的金屬，以及斜坡、轉(zhuǎn)盤、管道、秋千、蹺蹺板、小球等“玩具”。給予豐富環(huán)境干預(yù)120 min。同時配合播放舒緩的輕音，明暗紅色燈光照射。

E組予以頭穴叢刺后，將幼鼠放入EE籠中給予環(huán)境刺激120 min，拔針放回母鼠籠中。

1.4 內(nèi)源性NSCs的標(biāo)記[8]

將5-溴脫氧尿核苷(BrdU，美國SIGMA公司)用生理鹽水配制成5 mg/ml的溶液。各組分別于造模后24 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，每天1次，持續(xù)7 d。

1.5 免疫組化

將大鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注取腦。常規(guī)方法制成石蠟塊，應(yīng)用恒冷切片機(德國LEICA)切片，片厚4μm。0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗3次，每次5 min；切片入10 g/L H2O2，室溫30 min；加入2 mol/L HCl，37℃ 45 min；切片入0.1 mol/L硼酸(pH 8.5)10 min；100 g/L正常羊血清封閉，37℃30 min；加入一抗神經(jīng)巢蛋白(nestin)(1∶200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、BrdU(1∶200，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，4℃冰箱過夜；滴加過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠/兔IgG(MaxVionTM，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，避光條件下37℃孵育60 min；DAB顯色后，進行脫水、透明、封片。選擇側(cè)腦室下帶及額葉皮層處各3張切片，每張切片光鏡下選取4個高倍視野，計陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行分析。組間差異進行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BrdU陽性細(xì)胞數(shù)

BrdU陽性細(xì)胞呈棕黃色，分布于側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)和大腦皮層等部位。B組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與A組同期比較明顯增加(P＜0.01)。C、D、E組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與B組同期比較明顯增加(P＜0.01)；E組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)與C、D組同期比較增加(P＜0.05)。見表1。

2.2 nestin陽性細(xì)胞數(shù)

B組SVZ和大腦皮層nestin陽性細(xì)胞數(shù)與A組同期比較明顯增加(P＜0.01)；C、D、E組nestin陽性細(xì)胞數(shù)與B組同期比較明顯增加(P＜0.01)。各時間點C組、D組nestin陽性陽性細(xì)胞數(shù)相比無顯著性差異(P＞0.05)；E組nestin陽性細(xì)胞數(shù)與同期C組、D組比較明顯增加(P＜0.01)。見表2。

表1 各組Brd U陽性細(xì)胞數(shù)(/mm2)

表2 各組nestin陽性細(xì)胞數(shù)(/mm2)

3 討論

NSCs廣泛存在于哺乳動物中，產(chǎn)生NSCs的部位主要位于SVZ和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(SGZ)[9]。通常成年腦內(nèi)的NSCs處于靜息狀態(tài)，在某些因素的刺激下，NSCs會被激活并增殖，在其他趨化因子的作用下向損傷部位遷移、分化[10-11]。Zhang等在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，腦卒中后第2天大鼠SVZ NSCs開始增殖，第7天達(dá)到高峰，第14天時分裂細(xì)胞比例恢復(fù)至第2天水平[12]。

頭穴叢刺是于致順教授在大量的臨床經(jīng)驗和科研工作的基礎(chǔ)上對頭穴針刺系列研究的總結(jié)與深化。其頭穴叢刺長留針可以減少日針刺數(shù)，并達(dá)到足夠有效的刺激量，克服重復(fù)針刺給患者帶來的痛苦；同時頭穴叢刺法便于與康復(fù)方法結(jié)合，以康復(fù)技術(shù)代替體針治療，以動態(tài)治療方法代替靜態(tài)治療方法，可以起到相輔相成的作用。

新生兒出生后，神經(jīng)系統(tǒng)仍然沒有發(fā)育成熟，神經(jīng)細(xì)胞和突觸數(shù)量持續(xù)增加，直至2歲左右達(dá)到一個穩(wěn)定的水平。在此期間，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性極強，不斷發(fā)生神經(jīng)再生、分化、凋亡以及神經(jīng)元軸突的生長、剪切、髓鞘形成等過程。這可能是早期康復(fù)干預(yù)可行性的生物學(xué)基礎(chǔ)。近年來利用環(huán)境康復(fù)療法治療發(fā)育期腦損傷日益得到人們的重視。臨床研究也證實，發(fā)育早期豐富環(huán)境干預(yù)有利于腦發(fā)育和腦功能的發(fā)揮，豐富環(huán)境刺激可增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性，促進腦發(fā)育和腦損傷的修復(fù)[13]。環(huán)境康復(fù)療法有望成為臨床治療HIBD及減輕腦損傷后遺癥的經(jīng)濟、無創(chuàng)、無痛苦的有效方法。

大量的實驗研究表明，針刺和豐富環(huán)境刺激對內(nèi)源性NSCs的增殖分化后的神經(jīng)功能恢復(fù)都有重要作用。唐強等電針取穴曲池和足三里，觀察針刺對腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性NSCs增殖及遷移的影響，發(fā)現(xiàn)電針法能夠促進與增殖和遷移有關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)，改善NSCs增殖、遷移的微環(huán)境，促進NSCs分化[14]。Komitova等實驗發(fā)現(xiàn)，與未接受豐富環(huán)境刺激組比較，豐富環(huán)境可以促進腦缺血大鼠SVZ NSCs的增殖[15]。而我們在前期的實驗中證實，腦缺氧缺血后，頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激可促進海馬微管相關(guān)蛋白-2和突觸素的陽性表達(dá)[5]。早期給予頭穴叢刺和豐富環(huán)境刺激干預(yù)，可以明顯改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，甚至可能使學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)到正常水平[16-17]。

本實驗顯示，頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激可促進HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖、遷移，明顯優(yōu)于單純頭穴叢刺或豐富環(huán)境刺激，這可能是頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激促進腦缺氧缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的機制之一。

[1]鄭修元,李勝活,燕鐵斌.腦梗死與內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(8):783-787.

[2]陳光福,張?zhí)N芳,龍琦,等.早期干預(yù)對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響[J].實用兒科臨床雜志,2011,26(20):1575-1577.

[3]Shen CC,Yang YC,Chiao MT,et al.Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke[J].Curr Neurovasc Res,2010,7(1):6-14.

[4]陳光福,張?zhí)N芳,龍琦,等.豐富環(huán)境干預(yù)促進缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞增殖和功能修復(fù)[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2012,14(2):139-143.

[5]劉波,唐強,邢艷麗,等.頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬微管相關(guān)蛋白-2和p38表達(dá)影響的實驗研究[J].針灸臨床雜志,2011,27(2):63-66.

[6]華興邦.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,(1):1-5.

[7]Rosenberg AA,Muydaugh E.The effect of blood glucose concentration on post asphyxia cerebral hemodynamics in newborn lambs[J].Pediatr Res,1990,27(5):454.

[8]張紅星,張曉艷,周利,等.頭針對腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖及遷移的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,31(7):951-954.

[9]Whitman MC,Greer CA.Adult neurogenesis and the olfactory system[J].Prog Neurobiol,2009,89(2):162-175.

[10]Chu K,Kim M,Chae SH,et al.Distribution and in situ proliferation patterns of intravenously injected immortalized human neural stem-like cells in rats with focal cerebral ischemia[J].Neuroscience Res,2004,50(4):459-465.

[11]張小喬,李鸝,馬國平,等.重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對腦梗死大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活、增殖的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病,2012,19(2):76-79.

[12]Zhang RL,Zhang ZG,Roberts C,et al.Lengthening the G(1)phase of neural progenitor cells is concurrent with an increase of symmetric neuron generating division after stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(3):602-611.

[13]Pham TM,Winblad B,Granholm AC,et al.Environmental influences on brain neurotrophins in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2002,73(1):167-175.

[14]唐強,徐志華,白晶.電針對大鼠腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖遷移的影響[J].針灸臨床雜志,2008,24(8):49-51.

[15]Komitova M,Mattsson B,Johansson BB,et al.Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats[J].Stroke,2005,36(6):1278-1282.

[16]劉波,鄒偉,孔妍.頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后學(xué)習(xí)記憶能力影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(1):78-83.

[17]劉波,張鴻婷,唐強.針刺結(jié)合環(huán)境刺激治療缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的實驗研究進展[J].中國康復(fù)理論與實踐,2009,15(3):216-217.