藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)心房顫動(dòng)患者華法林使用劑量研究

傅永平+張子彥

[摘要] 目的 研究藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量是否優(yōu)于根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法。方法 選取來(lái)自門(mén)診或病房需要使用華法林抗凝心房顫動(dòng)的患者220例，將其分為兩組，一組按照藥理遺傳學(xué)方法確定的華法林劑量用藥，采取聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切核酸酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（PCR-RFLP）對(duì)患者進(jìn)行CYP2C9和VKORC1基因型分析，根據(jù)計(jì)算模型確定的華法林劑量用藥，并進(jìn)行調(diào)整。另一組根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥。觀察患者達(dá)標(biāo)穩(wěn)定時(shí)間、藥物調(diào)整的次數(shù)、終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值、抗凝過(guò)量的比例，并觀察隨訪過(guò)程中出血事件的嚴(yán)重程度和發(fā)生率。隨訪時(shí)間約半年。 結(jié)果 藥理遺傳學(xué)方法指導(dǎo)的華法林使用劑量與根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法相比，達(dá)標(biāo)穩(wěn)定時(shí)間、藥物調(diào)整的次數(shù)、終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值、抗凝過(guò)量的比例（1.8%：16.4%）、嚴(yán)重出血事件發(fā)生率均體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 藥理遺傳學(xué)方法指導(dǎo)的華法林使用劑量比根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法使用的劑量更加精確，劑量調(diào)整小而少，而且嚴(yán)重出血發(fā)生率低，對(duì)患者更安全，值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 華法林；心房顫動(dòng)；CYP2C9；VKORC1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R541.7+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）32-0151-04

Dose study on atrial fibrillation patients warfarin use based on pharmacogenetics

FU Yongping1 ZHANG Ziyan2

1.Department of Cardiology， Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000， China； 2.Department of Hematology， Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine in Shandong Province， Heze 274035， China

[Abstract] Objective To compare the strengths of warfarin based on pharmacogenetics or defined by clinical indicators. Methods Either from outpatient or inpatient department， 220 patients who needed anticoagulative treatment by warfarin were recruited. These cases were divided into two groups. Warfarin use method of one group was determined by pharmacogenetics， specifically， CYP2C9 and VKORC1 genotyping were carried out to ascertain and adjust use dosage by Polymerase chain reaction-restriction nuclease fragment length polymorphism（PCR-RFLP）. As for the other group， therapeutic regimen was defined by the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose and the proportion of anticoagulant overdose. Additionally， the severity and incidence of hemorrhagic events were closely observed during half years following up. Results Compared with traditional warfarin use regimen defined by clinical indicators， the results obtained by pharmacogenetics， including the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose， the proportion of anticoagulant overdose（1.8% compared to 16.4%）， and the incidence of severe hemorrhagic events were unanimously better and statistically difference （P<0.05）. Conclusion In terms of safety， dose accuracy， the frequency and scale of drug adjustment and the incidence of severe hemorrhagic events， warfarin use method determined by pharmacogenetics is superior to that defined by clinical indicators. Accordingly， it is worth promotion and application.endprint

[Key words] Warfarin； Atrial fibrillation； CYP2C9； VKORC1

我國(guó)心房顫動(dòng)患者數(shù)接近1000萬(wàn)，心房顫動(dòng)的主要危害是腦梗死，而腦梗死的致殘率高，使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，給患者及其家屬帶來(lái)巨大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)損失?？鼓委熌軌驕p少心房顫動(dòng)的栓塞發(fā)生率，但由于醫(yī)患雙方對(duì)其出血副作用的擔(dān)心，使用華法林抗凝人數(shù)很少。雖然有新型抗凝藥物的出現(xiàn)，但新型抗凝藥物價(jià)格昂貴，尚無(wú)針對(duì)性拮抗劑，在腎功能不全病人使用的局限性以及在瓣膜性心臟病應(yīng)用的局限性，大規(guī)模應(yīng)用新型抗凝藥物并不適合我國(guó)國(guó)情。相比之下，華法林價(jià)格便宜，每日服藥一次，腎功能不全患者無(wú)需調(diào)整劑量，所以華法林在抗凝治療中的地位尚無(wú)可替代。為更好地探索我國(guó)心房顫動(dòng)患者的華法林使用劑量的個(gè)體化差異，本研究以門(mén)診或病房房顫患者為研究對(duì)象，對(duì)CHA2DS2-VASC評(píng)分≥2分以上需要華法林治療的患者進(jìn)行研究。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選擇2012年10月～2013年12月心內(nèi)科門(mén)診或病房需要使用華法林抗凝的心房顫動(dòng)患者220例。其中男123例，女97例，年齡35～97歲，平均（57.5±12.5）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）漢族；（2）≥18歲；（3）心房顫動(dòng)患者；（4）CHA2DS2-VASC評(píng)分≥2；（5）簽知情同意書(shū)并能夠配合臨床隨訪觀察。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重的肝、腎功能不全或甲狀腺疾病；（2）近期手術(shù)史；（3）急性心肌梗死1個(gè)月內(nèi)；（4）活動(dòng)性消化性潰瘍；（5）感染性心內(nèi)膜炎；（6）必須長(zhǎng)期服用非甾體類(lèi)抗炎藥；（7）必須使用試驗(yàn)藥物以外的抗血小板、抗凝藥物及溶栓藥物；（8）惡性腫瘤；（9）處于妊娠期；（10）有血液系統(tǒng)疾病，血小板缺乏癥；（11）不能定期門(mén)診復(fù)診條件或治療過(guò)程中不能規(guī)律服藥；（12）拒絕隨訪。

1.2方法

由專(zhuān)人收集臨床資料和隨訪登記，與患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)，病例隨機(jī)分為兩組，一組為藥理遺傳學(xué)組（110例）：抽取外周靜脈血2 mL，提取基因組DNA，使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切核酸酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（PCR-RFLP）給患者進(jìn)行CYP2C9和VKORC1基因型分析，根據(jù)計(jì)算模型（http：//www.WarfarinDosing.org）確定的華法林劑量用藥，并進(jìn)行調(diào)整。另一組為臨床指標(biāo)組（110例）：根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥。華法林片由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字：H37021314，每片2.5 mg。兩組患者在性別、年齡、合并疾病病史及合并用藥等一般資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，見(jiàn)表1。

1.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析材料與方法

1.3.1 試劑 基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、10 mmol/L dNTPs、25 mmol/L氯化鎂、DNA 標(biāo)記物（采購(gòu)自加拿大Bio Basic Inc.）；引物由上海生工生物工程有限公司合成提供；限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅡ、Nsi I、Msp I及瓊脂糖（均購(gòu)自美國(guó)Promega）。

1.3.2 儀器 HH-W21.420型電熱恒溫水箱（天津泰斯特儀器有限公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；多功能暗箱式紫外線(xiàn)分析裝置（北京賽百奧公司）；FerroTec基因擴(kuò)增儀（杭州大和公司）；LX-100手掌型離心機(jī)（江蘇海門(mén)）。

1.3.3 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 取外周抗凝血液2 mL，使用基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。PCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-3]，VKORC1基因檢測(cè)的正向引物為5-GCCAGCA-GGAGAGGGAAATA-3，反向引物為5-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3；CYP2C9 *3基因檢測(cè)的正向引物為5-AATAATAATATGCACGAGGTCCAGAGATGC-3，反向引物為5-GATACTATGAATTTGG-GACTTC-3；CYP2C9 *2基因檢測(cè)的正向引物為5TACAAATACAATGAAAATATCATG-3，反向引物為5-CTAACAACCAGACTCATAATG-3。PCR反應(yīng)體系包括基因組DNA 0.2 μg，2.5 mmol/L，dNTPs 4 mL，10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL，10 μmol/L的引物各3 mL，5 u/L Taq聚合酶0.5 μL，加超純水至50 μL。CYP2C9*2反應(yīng)條件為：先94℃預(yù)變性5 min，然后94℃處理45 s，再50℃處理45 s，最后72℃處理1 min，共35個(gè)循環(huán)，接下來(lái)72℃延伸5 min；CYP2C9*3的反應(yīng)條件為：先94℃ 預(yù)變性5 min，然后94℃處理45 s，再56℃處理45 s，最后72℃處理30 s，共35個(gè)循環(huán)，接下來(lái)72℃延伸5 min；VKORC1-1639G>A的反應(yīng)條件為：先94℃ 預(yù)變性5 min，然后94℃處理45 s，再59℃處理30 s，之后72℃處理30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3.4 限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析 取用VKORCl、 CYP2C9 *2、CYP2C9 *3PCR產(chǎn)物各10 μL，然后分別加入限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅡ、Msp I、 Nsi I各0.5 μL以及牛血清白蛋白0.2 μL和緩沖液2 μL，再加入超純水至20 μL，37℃水浴4 h。酶切產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳，最后紫外燈下觀察條帶。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察兩組患者達(dá)標(biāo)穩(wěn)定時(shí)間（從給予首劑華法林開(kāi)始到INR值在達(dá)到治療范圍（2～3）且INR值穩(wěn)定所需要的時(shí)間）、藥物調(diào)整的次數(shù)、終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值、抗凝過(guò)量的比例（INR初次超過(guò)4的比例），并觀察隨訪過(guò)程中出血事件的嚴(yán)重程度和發(fā)生率。隨訪時(shí)間約半年。endprint

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)所有計(jì)量資料均先進(jìn)行單樣本正態(tài)分布檢驗(yàn)，正態(tài)分布或近似正態(tài)分布資料的組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用（x±s）表示。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C9和VKORC1基因型分析

藥理遺傳學(xué)的方法組共對(duì)110例患者采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切核酸酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）進(jìn)行CYP2C9和VKORC1基因型分析，CYP2C9基因具有高度多態(tài)性，在基因編碼區(qū)和非編碼存在許多單堿基突變，最主要的有3種： CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3， CYP2C9：*1型102例占92.7%；CYP2C9：*2型0例占0%；CYP2C9：*3型8例占7.3%。VKORC1發(fā)現(xiàn)有AA、AG、GG三種基因型，VKORC1：AA型81例占73.6%；VKORC1：AG型26例占23.7%；VKORC1：GG型3例占2.7%.

2.2 兩組臨床觀察指標(biāo)的差異

患者隨訪時(shí)間半年，半年后對(duì)兩組患者在達(dá)標(biāo)穩(wěn)定時(shí)間、藥物調(diào)整的次數(shù)、終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值、抗凝過(guò)量的比例、嚴(yán)重出血發(fā)生率進(jìn)行觀察和比較，藥理遺傳學(xué)的方法與臨床指標(biāo)組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均具有優(yōu)勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。兩組臨床觀察指標(biāo)的差異見(jiàn)表2。

表2 兩組臨床觀察指標(biāo)的差異（x±s）

注：藥理遺傳學(xué)組與臨床指標(biāo)組相比，各觀察指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

2.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析結(jié)果

對(duì)所有抗凝過(guò)量和嚴(yán)重出血患者都進(jìn)行CYP2C9和VKORC1基因型分析。出現(xiàn)抗凝過(guò)量共20例：基因類(lèi)型為CYP2C9*1，VKORC1：AA共10例，有4例出現(xiàn)嚴(yán)重出血，基因類(lèi)型為CYP2C9*3、VKORC1：AA共6例，有3例出現(xiàn)嚴(yán)重出血；基因類(lèi)型為CYP2C9*1、VKORC1：AG共1例，基因類(lèi)型為CYP2C9*3、VKORC1：AG共2例，基因類(lèi)型為CYP2C9*3；VKORC1：GG共1例。10例嚴(yán)重出血患者的VKORC1基因型均是AA。

3 討論

華法林在抗凝治療中的地位尚無(wú)可替代。但華法林治療窗很窄，而且用藥的個(gè)體性差異和種族差異也很大，要達(dá)到相同作用效果，最大劑量與最小劑量相差可以達(dá)到10倍以上。目前發(fā)現(xiàn)影響華法林藥效學(xué)的基因主要有2個(gè)，細(xì)胞色素氧化酶P450 2C9（cytochrome P-450 2C9，CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1（VKORC1）。華法林全部由肝臟代謝，CYP2C9是人類(lèi)肝臟中一種重要藥物代謝酶系統(tǒng)，是華法林代謝最關(guān)鍵的酶，CYP2C9基因具有高度多態(tài)性，在基因編碼區(qū)和非編碼存在許多單堿基突變，其中研究最多也是最主要的有3種，即野生型CYP2C9*1、突變體CYP2C9*2和突變體CYP2C9*3，這幾個(gè)等位基因的多態(tài)性可以影響華法林藥效，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)華法林的敏感性不同以及華法林在抗凝治療過(guò)程中出血的危險(xiǎn)性，對(duì)華法林的使用劑量密切相關(guān)的兩個(gè)等位基因分別為CYP2C9*2和CYP2C9*3?；蛐虲YP2C9*2和CYP2C9*3的患者所需的華法林治療劑量小[4，5]。VKORC1是人體內(nèi)維生素K依賴(lài)性凝血因子生成的限速酶和關(guān)鍵酶，華法林通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制此酶的作用而達(dá)到抗凝效果。VKORC1發(fā)現(xiàn)有AA、AG、GG三種基因型，AA基因型為華法林劑量敏感型，所需的華法林治療劑量小。AG、GG兩種基因型為華法林劑量抵抗型，所需的華法林治療劑量大[4，5]。納入藥理遺傳學(xué)的方法組的患者CYP2C9和VKORC1基因型發(fā)布見(jiàn)2.1。本研究中發(fā)現(xiàn)：CYP2C9基因型分布CYP2C9*1占92.7%，CYP2C9*2占0%，CYP2C9*3占7.3%。CYP2C9基因型分布以CYP2C9*1為主，與西方人相似[6-10]，可見(jiàn)CYP2C9基因型分布無(wú)明顯種族差異。本研究中：VKORC1基因型分布AA占73.6%，AG占23.7%，GG占2.7%。與文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)漢族人VKORC1基因型以AA型為主，GG、GA型少見(jiàn)相符[6-9]，而西方人以GG、GA型為主，AA型少見(jiàn)，提示VKORC1基因型存在人種差異[6-9]。已知CYP2C9*1、VKORC1-AA型基因的患者，所需華法林劑量減少，這可部分解釋我國(guó)漢族人所需華法林劑量低于西方人群的原因。

本研究通過(guò)對(duì)兩組間臨床觀察指標(biāo)（表2）的比較，藥理遺傳學(xué)的方法組與臨床指標(biāo)組比較，穩(wěn)定達(dá)標(biāo)時(shí)間更短，藥物調(diào)整的次數(shù)更少，終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值更小，抗凝過(guò)量的比例更低，嚴(yán)重出血事件發(fā)生率更低。藥理遺傳學(xué)的方法組各項(xiàng)指標(biāo)均具有優(yōu)勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。藥理遺傳學(xué)的方法組通過(guò)對(duì)影響華法林的藥代動(dòng)力學(xué)的最重要的兩個(gè)基因CYP2C9和VKORC1的檢測(cè)，還充分考慮了患者的年齡、體重因素來(lái)確定華法林的初始劑量。終點(diǎn)劑量與初始劑量的絕對(duì)差值小，提示藥理遺傳學(xué)的方法的推薦劑量更加精確。穩(wěn)定達(dá)標(biāo)時(shí)間縮短，藥物調(diào)整次數(shù)的減少，也勢(shì)必減少了反復(fù)抽血帶來(lái)的麻煩，還能夠提高患者的依從性。服用華法林藥物前讓醫(yī)生知曉影響華法林的藥代動(dòng)力學(xué)的最重要的兩個(gè)基因CYP2C9和VKORC1的情況，也可以增加醫(yī)生治療中的信心，提高華法林的使用率。藥理遺傳學(xué)的方法組嚴(yán)重出血事件發(fā)生率要明顯低于臨床指標(biāo)組，這提示其減少了華法林的不良反應(yīng)，提高了安全性。所以使用藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量更加高效安全。

本研究中觀察對(duì)象共發(fā)生抗凝過(guò)量例數(shù)20例，抗凝過(guò)量患者中基因型表現(xiàn)以CYP2C9*3或VKORC1：AA為多見(jiàn)，抗凝過(guò)量患者平均年齡（72.4±9.4）歲，也較大。觀察對(duì)象共發(fā)生9例嚴(yán)重出血，其中嚴(yán)重出血病人中7例抗凝過(guò)量，另外2例并未出現(xiàn)抗凝過(guò)量，但年齡較大，提示抗凝過(guò)量和年齡是出血的重要因素[4，11-14]。嚴(yán)重出血患者的VKORC1基因型均是AA，VKORC1基因型表現(xiàn)為AG、GG的嚴(yán)重出血病例沒(méi)有觀察到。CYP2C9*3且VKORC1：AA的患者嚴(yán)重出血發(fā)生率較高，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注此類(lèi)患者。嚴(yán)重出血患者平均年齡為71.5歲，高于本研究觀察對(duì)象的平均年齡。藥理遺傳學(xué)的方法能夠及早發(fā)現(xiàn)這些出血高?；颊?，避免嚴(yán)重出血的發(fā)生。這也是藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量組嚴(yán)重出血發(fā)生率低的主要原因。endprint

基于藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量比根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法使用劑量推薦劑量更加精確，劑量調(diào)整小而少，能更快到達(dá)INR治療范圍，而且嚴(yán)重出血發(fā)生率低，對(duì)患者更安全，值得推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-07-29）endprint

基于藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量比根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法使用劑量推薦劑量更加精確，劑量調(diào)整小而少，能更快到達(dá)INR治療范圍，而且嚴(yán)重出血發(fā)生率低，對(duì)患者更安全，值得推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-07-29）endprint

基于藥理遺傳學(xué)的方法指導(dǎo)華法林使用劑量比根據(jù)臨床指標(biāo)確定的華法林劑量用藥方法使用劑量推薦劑量更加精確，劑量調(diào)整小而少，能更快到達(dá)INR治療范圍，而且嚴(yán)重出血發(fā)生率低，對(duì)患者更安全，值得推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-07-29）endprint