番鴨細(xì)小病毒VP3基因和鴨IL-2基因真核融合表達(dá)載體的構(gòu)建

董嘉文，李林林，孫敏華，袁建豐，鄺瑞歡，胡奇林

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（MDPV）引起的一種急性傳染病，主要侵害1～3周齡的雛番鴨，故又稱為“三周病”。其發(fā)病率為26%～62%，病死率為22%～43%，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)種危害最嚴(yán)重的傳染病之一，嚴(yán)重地影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展[1]。目前，番鴨細(xì)小病毒病的預(yù)防主要以弱毒疫苗為主，但弱毒疫苗存在著毒力返強(qiáng)的缺點(diǎn)，而基因工程疫苗如核酸疫苗具有安全、穩(wěn)定性好、能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)疫苗的發(fā)展方向。

MDPV的基因組為單鏈、線狀DNA，MDPV全長(zhǎng)均為5 132 bp。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，該基因全長(zhǎng)1 605 bp，編碼534個(gè)氨基酸，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，也是MDPV的免疫保護(hù)性抗原[2-3]。白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)；同時(shí)也能激活B淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的體液免疫應(yīng)答[4]。CpG基序可直接活化免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)針對(duì)編碼抗原的特異性免疫應(yīng)答[5]。

因此，本研究將VP3基因和免疫刺激基序（CpG）克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2，構(gòu)建了番鴨細(xì)小病毒核酸疫苗質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3-CpG，并在BHK-21細(xì)胞中獲得表達(dá)。本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次把CpG基序引入含有表達(dá)MDPV VP3基因的核酸疫苗質(zhì)粒中，為研制新型番鴨細(xì)小病毒核酸疫苗奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒和單抗 MDPV gd分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存；pMD-dIL2質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院羅滿林教授惠贈(zèng)；pIRES-dIL2質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；鼠抗MDPV單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I，購(gòu)自NEB；預(yù)混Ex Taq、T4 DNA連接酶、MiniBest病毒RNA/DNA抽提試劑盒、DNA Marker，購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司；羊抗鼠IgG為Protein Tech Group公司產(chǎn)品。

1.3 MDPV VP3基因的克隆

1.3.1 引物合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的MDPV全基因組設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)引物，擴(kuò)增片段為1 623 bp。90 bp的CpG序列[7-9]含有6個(gè)GTCGTT基序、3個(gè)TTGCTT基序和2個(gè)AGCGCT基序，基序間以TT相連，由上海捷瑞生物工程有限公司合成并克隆至pGHB2317G載體。

MVP3-F：5'-CTAGCTAGCATGGCAGAGGGAG GAA-3'（Nhe I）；

MVP3-R：5'-CCGCTCGAGTTACAGATTCTGA GTCAA-3'（Xho I）；

CPG：5'-CG ACGCGT GTCGTT TT GTCGTT TT GTCGTT TT TTGCTT TC TTGCTT TC TTGCTT TC A GCGCT AGCGCT TC GTCGTT TT GTCGTT TT GTCGTT ACGCGT GC-3'（Mlu I）。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒DNA。PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混Ex Taq 25 μL，引物各2 μL，模板DNA 4 μL，用蒸餾水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4 MDPV核酸疫苗重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用Nhe I和Xho I雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2和VP3基因，按照常規(guī)方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3。用MluⅠ酶切pIRES-dIL2-VP3和pGH-CPG，按常規(guī)方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3-CPG。將構(gòu)建好的質(zhì)粒送測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.5 MDPV核酸疫苗重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在24孔培養(yǎng)板中接種傳代BHK-21細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%單層，將營(yíng)養(yǎng)液棄掉，用Hank′s洗滌細(xì)胞兩遍。接種轉(zhuǎn)染試劑，即在50 μL DMEM中加入Lipofectamine TM 2000輕輕混勻，另外取 50 μL DMEM加入純化質(zhì)粒DNA 1 μg混勻；然后將上述兩種稀釋液混合，室溫孵育20 min，加入細(xì)胞板內(nèi)，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用5 h，更換新鮮配制的含2%FCS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取細(xì)胞。

1.6 間接熒光抗體試驗(yàn)檢測(cè) pIRES-dIL2-VP3-CPG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，用PBS(pH值7.4)輕輕洗滌細(xì)胞3次；將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用乙醇:丙酮（4∶6）混合液室溫固定10 min，自然晾干后將鼠抗MPV單克隆抗體作為一抗（1∶50稀釋?zhuān)?7℃濕盒內(nèi)孵育 l h；PBS洗滌3次，加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（1∶100倍稀釋?zhuān)?7℃1 h后，PBS洗滌3次，在熒光倒置顯微鏡下鏡檢。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)pIRES空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 MDPV核酸疫苗重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Nhe I、Xho I雙酶切pIRES-dIL2和VP3基因，把VP3基因定向克隆至pIRES-dIL2中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒再進(jìn)行雙酶切鑒定。從圖1可見(jiàn)長(zhǎng)約6 460 bp（pIRES-dIL2）和1 605 bp（VP3基因）DAN條帶。重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3和pGH-CpG同時(shí)經(jīng)過(guò)MluⅠ酶切、連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3-CpG。從圖2可見(jiàn)長(zhǎng)約90 bp的CpG片段。由此證明，pIRES-dIL2-VP3-CpG重組表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)成功構(gòu)建。

2.2 間接免疫熒光抗體法檢測(cè)質(zhì)粒在 BHK-21的瞬時(shí)表達(dá) pIRES-dIL2-VP3-CpG重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，從圖中可以看到細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)了綠色熒光（圖3a），進(jìn)一步表明了pIRES-dIL2-VP3-CpG質(zhì)粒成功地在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而pIRES空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到熒光（圖3b）。

3 討論

MDPV基因組含有主要兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)右側(cè)ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，VP2和VP3基因編碼的氨基酸位于VP1基因內(nèi)部。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，約占總蛋白含量的80%。Le Gall-Recule[1]等利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)MDPV衣殼蛋白(VP2-VP3)，Western blotting證實(shí)重組的衣殼蛋白可以與MPV抗血清反應(yīng)。李雪梅等[9]將鵝細(xì)小病毒(GPV)番鴨細(xì)小病毒(MPV)主要結(jié)構(gòu)蛋白(VP2-VP3)基因克隆到核酸疫苗質(zhì)粒pIRES1neo載體上構(gòu)建了核酸疫苗，轉(zhuǎn)染鴨胚成纖維細(xì)胞后，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了禽IL-2蛋白，探討了禽IL-2真核表達(dá)質(zhì)粒和重組蛋白作為疫苗佐劑應(yīng)用的潛力[10-11]。近年來(lái)，CpG免疫佐劑已經(jīng)用于家禽和水禽的DNA疫苗研究中，石星明等[8]將CpG基序克隆至真核表達(dá)載體可作為新城疫病毒DNA疫苗的高效免疫增強(qiáng)劑，提高抗原特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)高水平保護(hù)性抗體。

本研究將VP3基因和CpG基序克隆至質(zhì)粒pIRES-dIL2中，構(gòu)建了核酸疫苗質(zhì)粒pIRES-dIL2-VP3-CpG，通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)染質(zhì)?？稍诩?xì)胞漿中檢測(cè)到綠色熒光，表明本試驗(yàn)構(gòu)建的核酸疫苗質(zhì)粒能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。引入CpG基序的MDPV核酸疫苗質(zhì)粒的成功構(gòu)建和表達(dá)為探索CpG作為MDPV核酸疫苗免疫增強(qiáng)劑的可能性以及為研制新型番鴨細(xì)小病毒核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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