西藏牦牛大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析

貢 嘎，王 剛，拉 珍，邢東義，索朗斯珠

（西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

大腸桿菌是人和動(dòng)物的腸道共棲菌和條件性致病菌。由于畜禽養(yǎng)殖期間大量、廣泛使用抗菌藥物，造成動(dòng)物源大腸桿菌耐藥株不斷增多，耐藥機(jī)制日趨復(fù)雜[1]，給動(dòng)物疾病防治帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；目前，細(xì)菌對(duì)常用抗生素產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)引起普遍的關(guān)注，其中大腸桿菌的耐藥性研究較為集中也較為深入[2]。大腸桿菌耐藥株引起的感染在臨床上不但有增多趨勢(shì)，而且其耐藥性亦不斷發(fā)生變遷[3]。而區(qū)牦牛大腸桿菌耐藥性的研究報(bào)道較少，本文從本區(qū)不同地區(qū)分離鑒定牦牛大腸桿菌，并對(duì)牦牛大腸桿菌耐藥性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 在拉薩當(dāng)雄、林芝、日喀則、阿里、那曲、昌都等地采集腹瀉牦牛新鮮無(wú)污染糞便，裝入自封袋，編號(hào)，待檢。

1.2 主要試劑 （1）普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板、生化培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室制備[4]；（2）藥敏紙片：共15種，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離與鑒定

1.3.1 分離培養(yǎng) 無(wú)菌取出待檢糞樣，接種在普通平板上，在37℃培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.3.2 鑒定 挑取普通平板上典型菌落分別接種在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍(lán)平板上劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。同時(shí)挑取典型菌落分別接種到生化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌操作選取分離細(xì)菌純培養(yǎng)物致密劃線于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將臨床常用的15種抗生素藥敏紙片貼于瓊脂平板表面中央處，倒置平皿，放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.5 抑菌結(jié)果的判定 參照NCCLS（2013）公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐藥（Resistant）3種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定，個(gè)別抑菌圈大小參考相關(guān)文獻(xiàn)作出判定，具體判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定

2.1.1 在普通平板上生長(zhǎng)出圓形、光滑、濕潤(rùn)、半透明、灰白色菌落。經(jīng)革蘭染色后發(fā)現(xiàn)革蘭陰性兩端鈍圓的直桿菌。

2.1.2 在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍(lán)平板上分別形成紅色菌落和帶金屬閃光的菌落。并能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、蔗糖，其中乳糖發(fā)酵最快。甘露醇、吲哚、甲基紅均陽(yáng)性，V-P、枸櫞酸、氧化酶呈陰性。

2.2 大腸桿菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)選用分屬6類抗菌藥物的15種抗菌藥物，其中β-內(nèi)酰胺類3種，氨基糖苷類5種，四環(huán)素類2種，喹諾酮類3種，酰胺醇類1種，其他1種。藥敏試驗(yàn)表明，西藏牦牛耐藥大腸桿菌對(duì)同類藥物之間存在交又耐藥性。見表1。

2.3 牦牛耐藥大腸桿菌的耐藥率

2.3.1 西藏牦牛大腸桿菌的耐藥情況 來(lái)自西藏拉薩當(dāng)雄、林芝、日喀則、阿里、那曲、昌都等地11個(gè)牦牛耐藥大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物有不同程度耐藥性。見表2，圖1。

表2 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 11株耐藥菌株的耐藥譜 11株牦牛耐藥大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物有不同程度的耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象較重（表3），最少為7種，最多為12種。8耐和11耐菌株所占總菌株比例最大為27.27%；其次是 9耐為18.18%；7耐、10耐、12耐菌株均占總菌株的9.09%。見圖2。

表3 牛源耐藥大腸桿菌的多重耐藥率

3 討論

3.1 牦牛大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及分析 已有研究表明,我國(guó)多重耐藥現(xiàn)象普遍嚴(yán)重[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，西藏牦牛腸道大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率極高，作者認(rèn)為，由于西藏老百姓文化水平較低，目前對(duì)細(xì)菌耐藥性的認(rèn)識(shí)不夠清楚，因此在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中普遍存在濫用抗生素以及嚴(yán)重缺乏聯(lián)合、交叉、輪換等用藥方式來(lái)減少細(xì)菌的耐藥率的意識(shí)。因此西藏牦牛大腸桿菌耐藥水平較高、耐藥譜較廣，多重耐藥現(xiàn)象較重。

大腸桿菌作為腸道菌，在條件變差及其他病原感染后易繼發(fā)致病。并且其血清型眾多，抗原復(fù)雜，變異大，菌株易產(chǎn)生廣泛的耐藥性和多重耐藥性，在實(shí)際生產(chǎn)中疫苗預(yù)防和藥物防治效果不理想。本試驗(yàn)采用WHO推薦的K-B紙片法檢測(cè)11株大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的敏感性。其中對(duì)頭孢唑啉、氨芐西林、多西環(huán)素、頭孢氨芐、呋喃妥因、新霉素的耐藥率較高，其中對(duì)頭孢唑啉耐藥率為100%，對(duì)后5種藥的耐藥率也高達(dá)90.9%，對(duì)四環(huán)素和鏈霉素的耐藥率達(dá)81.8%，對(duì)阿米卡星、阿莫西林和慶大霉素的耐藥率分別為72.7%和63.4%、對(duì)卡那霉素耐藥程度較低，達(dá)36.3%。；但耐藥菌株對(duì)氧氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星等藥物的敏感性較高，達(dá)90.9%～100%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，獸醫(yī)臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地使用，而且必須經(jīng)常更換抗菌藥種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株，同時(shí)較好地控制畜禽大腸桿菌病，只有這樣才能有針對(duì)性的選用敏感藥物。另一方面，盡量在飼料中少用抗菌藥，治療用藥必須合理，有針對(duì)性，在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中少并再不可濫用抗菌藥，還應(yīng)考慮采取聯(lián)合用藥、交叉或輪換用藥等方法[7]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本次從西藏牦牛體內(nèi)分離的大腸桿菌對(duì)頭孢唑啉、氨芐西林、多西環(huán)素、頭孢氨芐、呋喃妥因、新霉素的耐藥率較高，表明只有少數(shù)藥物對(duì)多數(shù)分離菌株有效，多數(shù)藥物的效力不理想，大量耐藥菌株的產(chǎn)生，已給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以對(duì)病原菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)勢(shì)在必行。因此建議在獸醫(yī)臨床上應(yīng)選停用耐藥性極強(qiáng)的藥物，應(yīng)選擇敏感性較高的藥物來(lái)針對(duì)性治療牦牛大腸桿菌病。

3.2 控制牦牛大腸桿菌耐藥性的對(duì)策 （1）大力宣傳細(xì)菌耐藥性等相關(guān)專業(yè)知識(shí)，提高老百姓對(duì)細(xì)菌耐藥性的意識(shí)，做到家喻戶曉，人人皆知；（2）實(shí)行管理部門與獸醫(yī)人員的指導(dǎo)下計(jì)劃性輪換、交叉或聯(lián)合用藥；（3）使用抗生素的同時(shí)，開發(fā)及利用傳統(tǒng)藏獸藥對(duì)降低細(xì)菌耐藥可能具有重要的意義；（4）治療用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，用藥必須合理、有針對(duì)性；而且必須經(jīng)常更換抗菌藥種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株；（5）應(yīng)以免疫預(yù)防為主，執(zhí)行嚴(yán)格的消毒隔離制度，同時(shí)動(dòng)物加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。

[1]馬紅霞，劉玉堂，傘治豪.不同動(dòng)物源性大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob的同源性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（12）:1035-1040.

[2]俞道進(jìn)，黃一帆，鄧文華，等.豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥性的流行病學(xué)調(diào)查[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，34（9）：357-360.

[3]Murray B E.New aspects of antimicrobial resistance and resulting the therapeutic dilemmas[J].J Infect Dis，1991，163:1185.

[4]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：36-42.

[5]呂殿紅，曾振靈，陳杖榴，等.大腸埃希菌多重耐藥性的形成機(jī)制[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（7）:76-81.