趙丹華 賀大權(quán) 楊旭 金迪 劉瀟 王朝霞 袁云
常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦?。╟erebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)是一種較常見的遺傳性腦小血管?。?],于1993年由法國(guó)人 Tournier-Lasserve等首次提出[2]。該病多在中年發(fā)病,臨床特征為反復(fù)發(fā)作的缺血性卒中、偏頭痛、精神異常和皮質(zhì)下癡呆[1]。頭顱MRI顯示多發(fā)的腔隙性腦梗死及廣泛的白質(zhì)疏松,尤其以顳極白質(zhì)異常信號(hào)最有提示意義[1,3]。其特征性的病理改變?yōu)樾?dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞表面出現(xiàn)顆粒性嗜鋨物質(zhì)(GOM)沉積,是診斷本病的金標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。
CADASIL由位于染色體 19p13.2-13.1 的NOTCH3基因突變所引起[4]。致病性NOTCH3基因突變也是確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫(kù) (www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)顯示,目前全世界已報(bào)道240余種突變,其中90%以上為錯(cuò)義或無(wú)義突變,還有少數(shù)為插入以及缺失突變,而剪切突變罕見,至今僅有3例[5-7]。我國(guó)目前已報(bào)道40余個(gè)CADASIL家系[8-12],全部為錯(cuò)義或缺失突變引起,尚無(wú)剪切突變的報(bào)道。本文通過分析1例CADASIL患者及其家系成員的臨床、影像學(xué)特點(diǎn),并對(duì)患者及部分家系成員進(jìn)行NOTCH3基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其存在NOTCH3基因剪切位點(diǎn)突變。
1.1 研究對(duì)象 收集1個(gè)CADASIL家系共5例患者的臨床及影像學(xué)資料,家系系譜見圖1。先證者經(jīng)超微病理檢查發(fā)現(xiàn)微小動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞表面以及毛細(xì)血管周細(xì)胞表面存在GOM沉積,符合CADASIL診斷標(biāo)準(zhǔn)。
圖1 CADASIL患者家系系譜圖
1.2 方法
1.2.1 臨床資料收集:回顧分析該家系先證者(Ⅲ-5)及家系成員中有癥狀患者的臨床表現(xiàn),主要包括發(fā)病年齡、首發(fā)癥狀及主要癥狀等;回顧分析先證者2次不同時(shí)期的頭MRI表現(xiàn)。
1.2.2 NOTCH3基因突變檢測(cè):提取先證者及其兄妹(Ⅲ-6及Ⅲ-7)的外周血白細(xì)胞DNA。使用Primer 3軟件對(duì)NOTCH3基因的熱點(diǎn)突變區(qū)域2-12號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物,具體引物序列及反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[13]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段,產(chǎn)物純化后,用 ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行直接測(cè)序。所有PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序。同時(shí)對(duì)100名健康對(duì)照者進(jìn)行NOTCH3基因4號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列測(cè)序。
1.2.3 突變的反轉(zhuǎn)錄分析:用Trizol試劑一步法從患者左肱二頭肌組織中提取總RNA,在 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),使用Primer 3設(shè)計(jì)引物覆蓋NOTCH3基因2-4號(hào)外顯子,上游引 物 序 列 為:5′-GTGTGCAAATGGAGGTCGTT-3′,下游引物序列為:5′-AAGGAGCCAGGTGTGTTGAG-3′。應(yīng)用瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物并進(jìn)行雙向測(cè)序。
2.1 臨床及影像學(xué)表現(xiàn) 該家系中3代共出現(xiàn)5例患者,且每代均有發(fā)病者。先證者為46歲男性,40歲出現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作;43歲患腦梗死,當(dāng)時(shí)查頭MRI示左側(cè)腦橋點(diǎn)狀新鮮梗死灶,同時(shí)雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)、左側(cè)胼胝體及雙側(cè)基底節(jié)可見多發(fā)陳舊腔梗灶,雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)及額頂顳葉皮層下白質(zhì)多發(fā)小片狀長(zhǎng)T2信號(hào),雙側(cè)顳極白質(zhì)及右側(cè)外囊呈長(zhǎng)T2信號(hào)(圖2);46歲開始出現(xiàn)記憶力減退,復(fù)查頭MRI示雙側(cè)基底節(jié)及半卵圓中心腔隙性腦梗死灶較以前增多,雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)及額頂顳葉皮層下白質(zhì)病變范圍較前擴(kuò)大,部分融合成片。先證者的弟弟(Ⅲ-7)30多歲時(shí)患“腦梗死”,目前遺留言語(yǔ)不清、記憶力減退、思維混亂表現(xiàn);父親(Ⅱ-3)約50歲時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、記憶力減退及運(yùn)動(dòng)遲緩等,后因癱瘓臥床去世;姑姑(Ⅱ-2)曾患“腦梗死”,現(xiàn)已去世;祖父(Ⅰ-1)早年死亡,原因不詳,去世前有動(dòng)作遲緩及言語(yǔ)不清表現(xiàn)。所有患者均無(wú)高血壓、糖尿病及高脂血癥等疾病。
圖2 先證者(43歲)患腦梗死時(shí)的頭MRI表現(xiàn):雙側(cè)側(cè)腦室周圍出現(xiàn)多發(fā)腔梗灶,同時(shí)可見腦白質(zhì)變性(A);雙側(cè)顳極可見T2高信號(hào)(B)
圖3 先證者的NOTCH3基因測(cè)序分析
2.2 基因檢測(cè) 先證者及其弟弟(Ⅲ-7)的NOTCH3基因3號(hào)內(nèi)含子的第77位堿基存在A>G雜合突變(c.341-2A>G,圖3A),使3號(hào)內(nèi)含子的剪切受體由AG變?yōu)镚G。而先證者無(wú)癥狀的妹妹(Ⅲ-6)以及100名健康對(duì)照者均沒有發(fā)現(xiàn)該突變。
2.3 反轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果 反轉(zhuǎn)錄PCR研究表明,c.341-2A>G突變使剪切位點(diǎn)發(fā)生改變,其中一條cDNA第4號(hào)外顯子的前21個(gè)堿基(c.341-361)被作為內(nèi)含子剪切下來(lái)(圖3B),致使4號(hào)外顯子mRNA起始的7個(gè)氨基酸(p.114-120,即甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、亮氨酸及脯氨酸)被跨越、未轉(zhuǎn)錄。
該家系連續(xù)3代均出現(xiàn)發(fā)病者,男女均可受累,符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。所有患者均在中年發(fā)病,主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的缺血性卒中及認(rèn)知功能減退;無(wú)高血壓、糖尿病及高脂血癥等腦血管病常見危險(xiǎn)因素;頭顱MRI顯示多發(fā)腔梗灶及廣泛的腦白質(zhì)變性;皮膚超微病理檢查發(fā)現(xiàn)微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表面出現(xiàn)GOM沉積,證實(shí)CADASIL的診斷。NOTCH3基因突變檢測(cè)證實(shí)存在c.341-2A>G剪切突變,從基因水平進(jìn)一步確診了該病。
先證者頭MRI改變特點(diǎn)為多發(fā)腔梗灶及彌漫性的白質(zhì)疏松,結(jié)合其雙側(cè)顳極白質(zhì)出現(xiàn)長(zhǎng)T2信號(hào)這一特征性表現(xiàn),高度提示CADASIL的診斷。研究發(fā)現(xiàn),CADASIL患者的頭MRI表現(xiàn)具有一定的演變規(guī)律[1],其腦白質(zhì)病變常早于腔梗灶出現(xiàn),最早在側(cè)腦室周圍及半卵圓中心區(qū)域觀察到點(diǎn)狀或結(jié)節(jié)狀的長(zhǎng)T2異常信號(hào),隨后病灶增多、融合,形成彌漫性的病灶。該文先證者的白質(zhì)病變隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸加重,符合這一特點(diǎn)。CADASIL患者的腔隙性梗死灶主要集中在基底節(jié)、丘腦及外囊等大腦深部結(jié)構(gòu),也見于腦室旁白質(zhì)、皮層下白質(zhì)、胼胝體及腦干等部位,而本例患者的腔梗灶以側(cè)腦室旁白質(zhì)及胼胝體為主,基底節(jié)病灶相對(duì)不明顯,提示該病的影像學(xué)表現(xiàn)也存在一定的異質(zhì)性。雖然胼胝體病變罕見于腦小血管病,但在CADASIL患者中并不少見,因此有助于鑒別CADASIL與其他類型的腦小血管?。?4]。
NOTCH3基因含有33個(gè)外顯子,編碼含有2321個(gè)氨基酸的跨膜蛋白,其胞外段含有34個(gè)表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)序列(EGFR),每個(gè)EGFR又包括6個(gè)半胱氨酸殘基[1]。除個(gè)別位點(diǎn)外,目前所報(bào)道的絕大多數(shù)突變均與EGFR中的半胱氨酸殘基有關(guān),即突變導(dǎo)致了半胱氨酸殘基的生成或丟失,而奇數(shù)的半胱氨酸殘基打破了原有正常的二硫鍵的形成,改變了編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)象[13]。本研究中,c.341-2A>G突變位于內(nèi)含子3的剪切受位,導(dǎo)致NOTCH3基因的mRNA剪切異常,產(chǎn)生了丟失7個(gè)氨基酸的截短蛋白,其中包括構(gòu)成第2個(gè)EGFR的第6位半胱氨酸殘基(p.117)。該氨基酸丟失后,無(wú)法與第108位的半胱氨酸殘基配對(duì)形成二硫鍵,進(jìn)而影響了該EGFR氨基端的雙層β折疊的穩(wěn)定性,使局部結(jié)構(gòu)發(fā)生錯(cuò)誤折疊而致?。?5]。同時(shí)該突變具有以下特點(diǎn):(1)在本家系中與臨床表型共分離;(2)國(guó)外CADASIL家系中也發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)[5];(3)NOTCH3基因 mRNA 全長(zhǎng)測(cè)序沒有發(fā)現(xiàn)其他致病性突變;(4)100名健康對(duì)照者沒有發(fā)現(xiàn)相同突變。因此綜合以上特點(diǎn)支持該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔儭?/p>
檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),本家系為目前已知第2個(gè)由c.341-2A>G剪切突變所導(dǎo)致的CADASIL家系。第一個(gè)家系位于法國(guó)東部,其7例受累成員主要表現(xiàn)為各種類型的偏頭痛,包括先兆偏頭痛、偏癱型偏頭痛、基底動(dòng)脈型偏頭痛以及無(wú)先兆偏頭痛,僅1例存在認(rèn)知功能減退[16],隨訪5年后發(fā)現(xiàn)有1例患者出現(xiàn)了缺血性卒中[5],偏頭痛常見于高加索CADASIL患者中[10]。而本家系成員則主要表現(xiàn)為腦梗死和癡呆,無(wú)明確偏頭痛及精神異常病史,與國(guó)內(nèi)CADASIL患者的臨床特點(diǎn)一致[10]。由此可見,雖然存在同一個(gè)突變位點(diǎn),但不同種族患者的臨床表現(xiàn)可以存在很大差異。目前除個(gè)別報(bào)道外[17],絕大多數(shù)研究均認(rèn)為CADASIL患者的基因型和臨床表型之間并無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系[7],而種族及地域因素的差異似乎對(duì)CADASIL患者臨床表型的影響更大[10,18]。
盡管目前報(bào)道的240余種NOTCH3基因突變中僅有3例是剪切突變(除c.341-2A>G外,另2例分別為位于3號(hào)內(nèi)含子深部的c.341-26_24delAAC以及位于15號(hào)內(nèi)含子剪切受位的c.2412-1G>T突變)[5-7]。但研究發(fā)現(xiàn),在人類所有致病性突變中,剪切突變是一種常見的突變類型,其中至少10%的突變?yōu)榘l(fā)生在剪切供位或受位的點(diǎn)突變[19],甚至在某些疾病中高達(dá)50%的突變是通過影響剪接過程而致?。?0]。由于病理證實(shí)的CADASIL患者中尚有5%~10%未發(fā)現(xiàn)致病性突變[21],因此應(yīng)該對(duì)這些患者進(jìn)行深入研究,以探討是否存在NOTCH3基因內(nèi)含子突變,特別是深在型內(nèi)含子突變。
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中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志2014年4期