HBV BCP區(qū)1762/1764和1896突變位點檢測新技術(shù)研究

王 澤，唐景峰

(1.陽泉市第三人民醫(yī)院，山西 陽泉 045000;2.武漢大學生命科學學院/病毒學國家重點實驗室，湖北武漢 430072)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)嚴重危害人類健康，是引起肝臟疾病的主要致病病毒之一［1，2］。全球約有20億人感染過HBV，其中慢性HBV攜帶者有4億人之多，每年造成的死亡人數(shù)約有100萬。乙型肝炎病毒的發(fā)病機制主要是機體清除HBV而引發(fā)的細胞免疫病理改變，較早的研究顯示在HBV感染過程中HBeAg的轉(zhuǎn)陰預示病毒的清除和疾病的好轉(zhuǎn)［3］。但近期研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒感染機體后，相當部分HBeAg轉(zhuǎn)陰是為逃避免疫清除而發(fā)生的變異［4～6］。

HBV DNA C區(qū)啟動子(The basal core promoter，BCP)負責調(diào)控編碼HBeAg和核心抗原的RNA的轉(zhuǎn)錄，BCP序列中的雙突變1762(A→T)和1764(G→A)經(jīng)常相伴出現(xiàn)，研究資料表明BCP雙突變與爆發(fā)性肝炎和慢性化有關(guān)［7］。前C區(qū)1896位點也是最常見的變異位點之一，該位點G-A的替換，使編碼色氨酸的密碼子UGG變?yōu)榻K止密碼子。1762/1764和1896的突變均可引起HBeAg不表達，逃避機體的免疫清除，故臨床檢測該基因變異對肝炎的治療有重要意義。本實驗采用錯配擴增和熒光PCR結(jié)合的突變分析法(MAMA-PCR)檢測基因突變［8～10］，每個位點含兩對特異性引物(A和B)和1條特異性含熒光標記的Taqman探針，引物A對野生型和突變型序列都能正常擴增，而引物B為錯配引物，對突變型序列能正常擴增，對野生型序列則不能擴增或擴增效率極低。對每個樣本均分別用引物A和引物B在不同的PCR管內(nèi)擴增，根據(jù)引物A和B兩者擴增所得Ct值的差異即可判斷位點突變的發(fā)生與否。

圖1 錯配擴增熒光PCR原理Fig 1 The Principle of Mismatch Amplification and Fluorescent PCR

本研究主要針對突變位點檢測，對比金標準測序法和MAMA-PCR熒光法樣本檢測的差異，分析MAMA-PCR法檢測樣本的準確性，為臨床HBV BCP區(qū)和前C區(qū)突變位點的檢測提供新的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2013年6月就診于山西省陽泉市第三人民醫(yī)院的被確診為慢性乙型肝炎患者血清132例，男70例，女62例，平均年齡36歲，均符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》中的慢性乙型肝炎的診斷標準。收集血清于－70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 SLAN96P實時熒光PCR儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司，ABI7500實時熒光PCR儀購自ABI公司，病毒核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，BCP區(qū)1762/1764和前C區(qū)1896位點基因突變檢測試劑盒購自武漢百泰基因工程有限公司，dNTPs和Taq酶等生化試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2.2 操作 a)樣本處理:取患者的血清及試劑盒中的對照品各100 μL，嚴格按照核酸提取試劑盒說明書分離提取樣本核酸用于項目檢測。b)測序檢測:從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找 HBV 不同亞型核酸序列，經(jīng)同源比對后選擇保守區(qū)域針設(shè)計PCR擴增引物(見表1)。

表1 各組反應(yīng)引物和探針序列Table 1 Various Reaction of Primer and Probe Sequence

結(jié)果判斷標準:如果樣品PCR反應(yīng)管A擴增曲線不呈S型或Ct(A)＞36，判定樣品HBV DNA含量小于檢測下限;若|Ct(A)-Ct(B)|≤7.00，則該樣本的檢測位點存在突變;若|Ct(A)-Ct(B)|＞7.00，則該樣本的檢測位點為野生型突變的含量超出檢測下限，即不存在突變。

PCR擴增程序為94℃，5 min;94℃，10 s;56℃，30 s;72℃，45 s;34 cyc;72℃，10 min。PCR 產(chǎn)物電泳切膠回收，送生物工程(上海)股份有限公司測序，分析基因位點是否為突變。c)熒光PCR擴增:通過軟件Primer Express 3.0設(shè)計特定位點引物和探針，經(jīng)引物篩選及體系優(yōu)化后獲得最優(yōu)的組合(見表1)，用于HBV樣本檢測。每個位點的檢測分為A和B兩管進行，反應(yīng)體系為 50 μL:5 μL 10 × buffer，0.2 mM dNTPs，0.4 mM dUTP，1 U UNG，0.4 μM 引物，探針0.2 μM，2 U Taq 酶。反應(yīng)條件為:50℃，2 min;95℃，3 min;95℃，10 s;60℃，1 min，40 cyc(收集熒光信號)。

2 結(jié)果

2.1 MAMA-PCR突變方法性能評估

穩(wěn)定性和精密度檢測:以該方法組裝的科研試劑中野生型和突變性陽性參考品作為模板，分別以A和B反應(yīng)液檢測3次，每次反應(yīng)設(shè)置10個重復，分析批間和批內(nèi)差異，對方法的重復性進行考核。結(jié)果表明，BCP區(qū)1762/1764雙突變和前C區(qū)1896突變試劑A反應(yīng)液檢測兩種參考品的Ct值基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);B反應(yīng)液檢測突變參考品的Ct值約為16，野生型參考品Ct值約為25.5，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均＜5%，突變型和野生型的Ct值差異約為9.9，見表2和表3。

表2 BCP區(qū)1762/1764雙突變檢測試劑穩(wěn)定性和精密度Table 2 The Stability and Precision of 1762/1764 of the BCP Double Mutations

表3 前C區(qū)1896突變檢測試劑穩(wěn)定性和精密度Table 3 The Stability and Precision of Precore 1896 Site Mutation Test Reagents

2.2 特異性和靈敏度檢測

依據(jù)特異性參考品選取原則，選定甲型肝炎病毒I型2份、甲型肝炎病毒Ⅱ型3份、丙型肝炎病毒Ⅰ型2份、丙型肝炎病毒Ⅱ型1份、戊型肝炎病毒Ⅰ型1份、戊型肝炎病毒Ⅳ型1份，共10份特異性參考品，所有檢測結(jié)果均為陰性，MAMA-PCR試劑的特異性高，不存在交叉檢測問題;以1.0×104 IU/mL的最低檢測限突變型參考品檢測20次，結(jié)果顯示均為陽性，證明反應(yīng)試劑的靈敏度可達到1.0×104 IU/mL(見圖2)。

圖2 靈敏度檢測:1.A反應(yīng)液2.B反應(yīng)液Fig 2 The Sensitivity Detection:1.A The Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

2.3 試劑檢測混合型HBV性能評估

將突變型和野生型質(zhì)控品按照比例混合制備成突變型含量比例100%，90%，50%，20%，10%，1%和0的參考品，以1762/1764和1896兩個試劑的A反應(yīng)液和B反應(yīng)液進行檢測，結(jié)果表明BCP區(qū)1762/1764雙突變和前C區(qū)1896位點突變試劑檢測1%突變含量的混合參考品的Ct值差異均大于理論值6.6，可達到7，證明試劑可檢測出1%突變比例的HBV樣本(見圖3，圖4)。

圖3 1762/1764不同突變含量HBV檢測(Ct):1.A反應(yīng)液2.B反應(yīng)液Fig 3 1762/1764 Different mutations Content and HBV Detection(Ct):1.A Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

圖4 1896不同突變含量HBV(Ct)檢測:1.A反應(yīng)液2.B反應(yīng)液Fig 4 1896 Different Mutation HBV(Ct)Test:1.A Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

2.4 HBV樣本BCP區(qū)和前C區(qū)核酸測序分析

132份樣本核酸提取后經(jīng)過PCR擴增后測序，與野生型HBV核酸序列比對分析(見圖5)。

圖5 樣本測序圖譜(1～3為1762/1764位點，4～6為1896 位點):1，4:野生型 2，5:突變型 3，6:混合感染型Fig 5 Sample Sequencing Atlas(1～3:1762/1764 Site，4～6:1896 Site):1，4:Wide Type 2，5:Mutant Type 3，6:Mixed Infection Type

分別統(tǒng)計1762/1764雙突變和1896突變情況:檢測出67例1762/1764雙突變數(shù)，突變比例為50.8%;檢測出39例1896突變，突變比例為29.5%，1762/1764和1896同時突變15例，突變比例11.4%，見表4。

2.5 HBV樣本突變試劑盒檢測分析

樣本提取后嚴格按照試劑盒說明書進行PCR檢測及結(jié)果判斷，經(jīng)統(tǒng)計BCP區(qū)雙突變例數(shù)為69，突變比例52.3%，前C區(qū)1896位點突變例數(shù)為41，突變比例31.1%，1762/1764和1896同時突變18例，突變比例13.6%，見表4。

HBV樣本BCP區(qū)和前C區(qū)核酸MAMA－PCR法分析，HBV樣本檢測結(jié)果表明BCP區(qū)雙突變例數(shù)為69，突變比例52.3%，前 C區(qū)1896位點突變例數(shù)為42，突變比例31.8%，1762/1764和1896同時突變17例，突變比例12.9%，見表4。

表4 HBV測序法和PCR法對比統(tǒng)計Table 4 Comparison Statistic of HBV Sequencing and PCR Method

3 討論

HBeAg陽性在較早的研究中被認為是病毒在體內(nèi)復制旺盛的一個重要指標，HBeAg由陽性轉(zhuǎn)為陰性是部分病毒被清除以及病情緩解的標志。研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陽轉(zhuǎn)陰的感染者病情并非都趨于好轉(zhuǎn)，相當部分的慢性肝病患者都檢測到HBeAg陰性，但具有更高的HBV DNA復制活力。這主要是由HBV核酸突變導致HBeAg不表達或表達量下降引起，這些突變主要包括BCP區(qū)的1762/1764位點的雙突變和前C區(qū)的1896位點突變引起。BCP區(qū)是HBV前C區(qū)mRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件，BCP區(qū)1762A→T1764G→A的聯(lián)合位點變異被認為可能阻礙前C區(qū)mRNA轉(zhuǎn)錄，從而造成HBeAg滴度下降或消失［6］。HBV前C區(qū)突變最常見的位點為nt 1896G-A的變異，使密碼28由色氨酸TGG變換成終止密碼TAG，導致HBeAg合成終止，在血清學上表現(xiàn)為HBeAg陰性，亞洲平均50%HBeAg陰性的慢性乙肝患者存在前C區(qū)突變。目前用于核酸位點突變檢測的方法主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)、DNA直接測序、限制性內(nèi)切酶分析、同位素標記寡核苷酸探針技術(shù)和微型DNA陣列［11～13］。其中測序法是運用較為廣泛和準確的方法，但也存在操作復雜、檢測周期長和檢測靈敏度較低的不足，對混合型30%以下的突變?nèi)菀状嬖诼z的現(xiàn)象。微型DNA陣列是新開發(fā)出來用于檢測多位點突變的方法，其主要優(yōu)勢在于可同時檢測多個位點。

本研究采用錯配擴增和熒光PCR結(jié)合的突變分析法(MAMA-PCR)檢測HBV BCP區(qū)和前C突變，同時采用科研試劑盒和金標準測序法比對檢測結(jié)果的準確性。在進行樣本檢測比對之前首先對MAMA-PCR兩個檢測位點的試劑性能進行檢測與評估，檢測結(jié)果表明BCP區(qū)1762/1764和前C區(qū)1896位點基因突變檢測試劑的時間與批次的CV%均＜5%，重復性好，10份特異性參考品檢測均為陰性，證明反應(yīng)特異性好，不存在交叉檢測，同時其檢測靈敏度可達到104IU/mL;對于感染混合型HBV樣本，本試劑可穩(wěn)定檢測出1%突變含量的樣本。MAMA-PCR法樣本檢測1762/1764結(jié)果與試劑盒一致，1896位點多檢出1例樣本，這1例樣本的核酸含量較低，處于臨界范圍區(qū)間，故可認為結(jié)果基本一致;測序法兩個位點突變檢出率均低于MAMA-PCR和試劑盒，分析可能由于測序法對低于30%突變比例的樣本存在漏檢引起。測序法作為金標準對核酸位點的檢測具有直觀，高通量的優(yōu)點，特別針對同一區(qū)間的多個突變，可一次性檢測出所有位點，在臨床上仍然具有不可替代的作用。但對于單位點的突變檢測，MAMA-PCR具有更高的靈敏度，檢測更為準確便捷。本研究采用MAMA-PCR方法針對1762/1764和1896位點開發(fā)的檢測試劑與已有試劑盒檢測結(jié)果無差異，豐富了HBV1762/1764和1896位點的檢測方案，將為HBV患者治療方案的制定提供依據(jù)。

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