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    優(yōu)化玫瑰紅鵝膏培養(yǎng)條件及抑菌活性研究*

    2014-11-21 03:38:00包海鷹
    中國食用菌 2014年1期
    關鍵詞:類毒素鵝膏玫瑰紅

    張 楠,包海鷹

    (吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院,食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長春 130118)

    鵝膏菌是一個世界性分布的大屬,有毒蘑菇中最重要的一類。目前已定名的約有500多種[1]。屬于擔子菌亞門 (Basidiomycotina)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、鵝膏科 (Amanitaceae)、鵝膏屬 (Amanita Pers.:Gray)[2]。鵝膏菌中主要的毒素為肽類毒素,共有3大類22種,分別為鵝膏毒肽 (Amatoxins)9種、鬼筆毒肽 (Phallotoxins)7種和毒傘素 (Vrotoxins)6種。肽類毒素由于獨特的生物學特性,目前廣泛應用于生物學、醫(yī)學、遺傳學、生物化學、基因工程,病毒等研究領域[3-5]。由于鵝膏屬大多數(shù)與針科或殼斗可形成外生菌根菌[6],尚無人工栽培。國內(nèi)毒素來源美國Sigma公司,每毫克價格在1.2×105美元~1.4×105美元。

    因為鵝膏屬在真菌中的關鍵性地位以及其毒素的特殊性,人工培養(yǎng)鵝膏菌的努力從來沒有停止過。為了更方便地研究鵝膏菌,人工純培養(yǎng)正在逐步成為一個研究熱點[7]。

    依據(jù)包海鷹教授多年來對長白山產(chǎn)鵝膏屬真菌的調查研究,以及對7種長白山產(chǎn)鵝膏屬真菌肽類毒素的高效液相分析[8,9],發(fā)現(xiàn)了玫瑰紅鵝膏 A.pallidorosea,其具有資源豐富、毒素含量高等特點。本試驗對玫瑰紅鵝膏進行液體發(fā)酵培養(yǎng),并對發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素進行分離提取,研究其藥理活性,為毒素獲得提供新的資源,進一步豐富了鵝膏毒肽藥理作用方面的研究內(nèi)容。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    玫瑰紅鵝膏Amanita pallidorosea,采自吉林省輝南縣朝陽鎮(zhèn)樣子哨。

    1.2 儀器和試劑

    1.2.1 儀器

    安捷倫1100高效液相色譜儀;色譜分析柱:分析柱YWG-C18柱 (150 mm×4.6 mm,10 μm),北京分析儀器廠,半制備柱 VenusⅡ MP-C18柱 (250 mm ×10 mm,10 μm),Agela Technologies;二氧化碳培養(yǎng)箱,NAPCO法國;離心機SORVALL;電子分析天平,SHIMADZU-AUY220型。

    1.2.2 試劑

    醋酸銨 (美國Sigma公司);乙腈和甲醇 (色譜純);冰醋酸和石油醚 (分析純);洗脫液A相:10%乙腈和90%0.02 mol·L-1醋酸銨,冰醋酸調節(jié)pH值至5.0;洗脫液B相:30%乙腈和70%濃度0.02 mol·L-1醋酸銨,冰醋酸調節(jié)pH值至5.0;純凈水 (杭州娃哈哈公司)。

    標準品:a-鵝膏毒肽 (a-AMA)、β-鵝膏毒肽 (β-AMA)、二羥鬼筆毒肽 [Phalloidin(PHD)],以上3種標準品均由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所提供。

    1.3 液體深層培養(yǎng)方法

    1.3.1 基礎培養(yǎng)基 (改良PDM)

    馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、磷酸二氫鉀3 g·L-1、硫酸鎂 0.5 g·L-1、磷酸氫氨 0.5 g·L-1、氯化鈣0.05 g·L-1、硝酸鉀 0.1 g·L-1、麥芽汁 (12 波美度)120 mL、VB10.01 g·L-1。

    1.3.2 菌種培養(yǎng)

    斜面菌種于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后,將適量菌絲接入最適培養(yǎng)基中,然后置于恒溫振蕩器上,150 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d。

    搖瓶發(fā)酵:250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液,接種量5%(v·v-1),置于 26℃恒溫振蕩器上,150 r·min-1振蕩培養(yǎng) 25 d。取25 d的發(fā)酵菌絲體,于烘箱中60℃烘至恒重,電子天平稱重并記錄。

    1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

    試驗設計采用中心組合旋轉設計 (Box-Benhnken)法,對溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)進行優(yōu)化設計。各因素及其編碼水平的設計見表1。

    表1 中心組合旋轉設計的變量及水平

    1.4 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測

    1.4.1 粗毒液的制備

    菌種培養(yǎng)完成后,將發(fā)酵液過濾,收集濾渣和濾液,把菌絲體在60℃下烘干后研磨。取1 g研磨后的菌絲體粉末,溶于10 mL 50%甲醇中,室溫下振蕩抽提24 h,8 000 r·min-1離心收集上清液。沉淀以10 mL 50%甲醇室溫下振蕩抽提24 h,8 000 r·min-1離心收集并合并上清液。用石油醚去脂2次,然后冷凍干燥,凍干的樣品用超純水溶解,再用0.22 μm的微孔濾膜過濾,得到鵝膏粗毒液。

    1.4.2 HPLC測定參數(shù)

    使用安捷倫1100高效液相色譜儀分離梯度模式為:0→15 min,B 0→5%,A 100%→95%;15 min→35 min,B 5%→80%,A 95%→20%;35 min→40 min,B 80%,A 20%;40 min→45 min,B80%→100%,A20%→0%;45 min→50 min,B 100%;50 min→55 min,B 100%→0%,A 0→100%并保持10 min。純化梯度模式:與分離梯度模式相同。檢測波長:295 nm;柱溫:40℃;流速:分析柱1 mL·min-1;半制備柱:2 mL·min-1。進樣量:分析柱 10 μL,半制備柱 1 mL。

    1.4.3 HPLC分離純化

    先在分析柱上篩選出最適宜的色譜條件,后在半制備柱上進行毒素的分離和純化,得到2種化合物。冷凍干燥后,用高效液相進行檢測。分離純化結果用Finnigan-MAT.LCQ電噴霧質譜儀進行鑒定。

    1.5 對植物病原菌的抑制活性

    1.5.1 供試病原真菌

    香瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum),菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所提供。

    1.5.2 指示菌的培養(yǎng)

    首先將試管斜面保存的菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上,等菌種長好后,用直徑7 mm的打孔器制成菌塊。

    1.5.3 供試品對菌絲生長的影響

    采用生長速率法[10-12]。取質量濃度為 105 μg·mL-1的粗提物溶液200 μL,混合于100 mL的PDA培養(yǎng)基中,配制以下濃度的含毒培養(yǎng)基,即玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液:200 μg·mL-1[13]、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1;發(fā)酵產(chǎn)物:800 μg·mL-1、400 μg·mL-1、200 μg·mL-1;不添加任何供試品的平板培養(yǎng)基作為空白對照。每個樣品設置3個重復。將已制好的菌塊接種于含毒的平板培養(yǎng)基中,置于26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。然后,用十字交叉法測抑菌率 (%),公式為:

    式中:R1為對照菌落直徑;R2為處理菌落直徑。

    1.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理,計數(shù)資料采用x±SD表示。p<0.05說明在統(tǒng)計學上呈顯著差異,p<0.01說明在統(tǒng)計學上呈極顯著差異,有統(tǒng)計學意義。

    2 結果與分析

    2.1 液體深層培養(yǎng)

    2.1.1 不同溫度對菌絲體重量的影響

    設置20℃、23℃、26℃、30℃、33℃、36℃共計5個不同的溫度處理 (溫度變幅為±1℃),結果見圖1。

    結果表明,玫瑰紅鵝膏菌絲體在26℃下培養(yǎng),菌絲體干物質重量最高,生長狀態(tài)最好。當溫度達到33℃時,菌絲體生長極其緩慢,當溫度達到36℃時,菌絲體基本停止生長。可能溫度過高會導致菌體內(nèi)的酶活性降低或者喪失。

    2.1.2 不同pH值對菌絲體重量的影響

    設置4、5、6、7、8共計5個不同的 pH值處理。用1 mol·L-1的HCl和NaOH調節(jié)培養(yǎng)基的pH值,結果見圖2。

    結果表明,玫瑰紅鵝膏菌絲體在pH值為6的條件培養(yǎng)時,菌絲體干物質重量最高。

    2.1.3 不同轉速對菌絲體重量的影響

    設置 80 r·min-1、100 r·min-1、120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1共計5個不同的轉速處理,結果見圖3。

    結果表明,玫瑰紅鵝膏菌絲體在140 r·min-1振蕩培養(yǎng)時,菌絲體干物質重量最高。

    2.1.4 Box-Benhnken實驗分析

    中心組合旋轉試驗設計及結果見表2。

    表2 中心組合旋轉試驗設計及結果

    本試驗以玫瑰紅鵝膏菌絲體干重 (g)為響應變量,以溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)為影響因子,進行 Box-Behnken響應面分析,利用統(tǒng)計軟件SAS8.0對試驗結果進行統(tǒng)計分析,可建立二次回歸方程 (編碼后):

    Y=+1.00-0.018×A+0.020×B+0.068×C+0.052×A×B+5.500E-003×A×C+0.055×B×C-0.15×A2-0.16×B2-0.061×C2,相關系數(shù) R2=99.67%,修正相關系數(shù) R2Adj=99.24%。

    對二次回歸方程進行方差分析,結果見表3。

    表3 二次回歸方程方差分析表

    回歸模型達到極顯著水平 (p<0.01)而誤項不顯著,說明回歸方程與實際情況較吻合,試驗誤差小,因此可利用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由表3可知,模型的一次項A、B、C極顯著;二次項均極顯著;交互項AB、BC極顯著,AC不顯著。這表明各種因素對于菌絲體重量的影響不是簡單的線性關系。

    2.1.5 因素間的交互作用

    根據(jù)回歸方程并利用Design-Expert軟件作不同因素的響應面分析圖和等高線圖,溫度、pH值和轉速三因素及其交互作用對菌絲體重量的影響結果通過圖4~圖6直接反應出來。

    結果表明,等高線的形狀可以反映出因素間交互效應的強弱,圓形表示兩因素間的交互效應不顯著,橢圓形表示顯著。

    2.1.6 玫瑰紅鵝膏發(fā)酵條件的優(yōu)化與結果驗證

    對方程Y=+1.00-0.018×A+0.020×B+0.018×C+0.052×A×B+5.500E-003×A×C+0.055×B×C-0.15×A2-0.16×B2-0.061×C2,最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度25℃、pH值6、轉速為156 r·min-1,其所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重為1.034 g。

    2.1.7 回歸模型驗證試驗

    根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)條件對模型進行驗證,3次平行驗證試驗所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重均值為1.054 g,優(yōu)化后提高了1.02倍,實際值與預測值的誤差為+2.8%。表明響應面法優(yōu)化玫瑰紅鵝膏最佳培養(yǎng)條件是有效可行的。

    2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測

    將菌絲體粗提物液通過液相進行分離純化。液相保留時間,因不同的分離條件和不同的色譜柱,保留時間有一定的差異,但是各個化合物在液相上的出峰順序保持不變。同時根據(jù)液相色譜質譜聯(lián)用儀和內(nèi)標法確定化合物,得到2個化合物,但是其含量較低?;衔?在分析柱上檢測結果如圖7所示。

    檢測化合物1保留時間是11.41 min,純度較高。電噴霧質譜[M+Na]峰是941,MW是918(圖8)。根據(jù)色譜保留時間和分子量,判斷組分為α-鵝膏毒肽 (α-AMA),分子式為C39H54N10O14S。

    化合物2在分析住上檢測結果如圖9所示,檢測化合物2保留時間是7.92 min。電噴霧質譜 [M-H]峰是918,MW是919(圖10)。根據(jù)色譜保留時間和分子量,判斷組分為β-鵝膏毒肽 (β-AMA),分子式C39H53N9O15S。

    2.3 對植物病原菌的抑制活性

    2.3.1 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用

    玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表4。

    表4 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌抑制作用 (n=3)

    由表4可以看出,鵝膏粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為 200 μg·mL-1時抑制率最高,為42.47%,100 μg·mL-1時作用力次之,50 μg·mL-1時抑制率最低,且與空白組對比呈極顯著差異 (p<0.01)。

    2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用

    發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表5。

    表5 發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用 (n=3)

    由表5可知,發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為800 μg·mL-1時抑制率最高,為 21.29%;400 μg·mL-1時作用力次之,且與空白組對比呈極顯著差異(p <0.01);200 μg·mL-1時抑制率為 0。

    3 討論

    經(jīng)過響應面方法優(yōu)化,獲得了最佳培養(yǎng)條件,即溫度為25℃,pH值為6,轉數(shù)為156 r·min-1。此培養(yǎng)條件更適合玫瑰紅鵝膏菌絲體的生長。同時,在其發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到2種毒素α-AMA和β-AMA。但是毒素含量較低,如何提高發(fā)酵產(chǎn)物中的毒素含量有待于更進一步的研究。

    玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物對香瓜枯萎病菌有不同的抑制作用。當子實體濃度為200 μg·mL-1時抑制率最高,為42.47%。可能是肽類毒素對植物病原菌有抑制作用,因為玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素的含量不同,造成了抑菌效果的差異。鵝膏肽類毒素影響真菌細胞內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ的活性,進而抑制了真菌細胞內(nèi)DNA和RNA的合成,繼而阻礙了蛋白質的合成,從而導致了細胞的死亡[14,15]。其作為新型的生物農(nóng)藥有待于更進一步的研究和應用。

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