大球蓋菇栽培期間胞外酶活性變化研究

于 萍，孫 萌，傅常娥，陳艷秋，尹勇剛

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

大球蓋菇 (Stropharia rugosoannulata Farlow)，別名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇、裴氏球蓋菇、裴氏假黑傘，屬于擔子菌亞門 (Basidomycota)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、球蓋菇科 (Strophariaceae)、球蓋菇屬 (假黑傘屬)(Stropharia)[1]。大球蓋菇色澤艷麗，子實體肉質嫩滑、爽口，菌蓋細膩軟滑，菌柄清香脆甜，干菇香味濃郁。大球蓋菇主要分布于歐洲、北美洲、亞洲等地，是許多歐美國家人工栽培的食用菌之一，也是國際菇類交易市場的十大菇類之一和聯(lián)合國糧農組織(FAO)向發(fā)展中國家推薦栽培的重要食用菌之一[2]。大球蓋菇是一種美味食用菌，營養(yǎng)價值較高，而且還有一定的保健和藥用價值[3，4]。

大球蓋菇對秸稈、樹枝等農林廢棄物具有很好的降解能力，可生料栽培，但與其降解木質纖維素密切相關的胞外酶活性變化的研究至今未見報道。雖然我國引種大球蓋菇較晚，但地理氣候適宜，并且秸稈、稻草等農業(yè)廢棄物來源豐富，成本低廉，具有極大的栽培大球蓋菇的優(yōu)勢和潛力。大力發(fā)展大球蓋菇，可促進農業(yè)廢棄物的合理利用，減少其帶來的環(huán)境污染，同時減少對木材及木材下腳料的應用，避免由于發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)而造成的毀林現(xiàn)象，可帶來可觀的經(jīng)濟效益和社會效益[5]。大球蓋菇生料栽培期間胞外酶活性變化的研究，將對深入研究其營養(yǎng)生理和指導其栽培具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

供試的大球蓋菇菌株采自長白山地區(qū)，經(jīng)組織分離后獲得純菌株，由延邊大學農學院應用真菌實驗室保存。

1.2 大球蓋菇栽培種制作

栽培種共設置5種培養(yǎng)料配方，以稻草、豆秸稈、玉米秸稈、玉米芯及木屑為主料，蔗糖、石膏粉為輔料，按照栽培種培養(yǎng)料配方進行常規(guī)拌料、裝桶，含水量保持在65%～75%，選取菌絲長勢優(yōu)良且一致的大球蓋菇原種制作栽培種，每個處理重復3次。

栽培種培養(yǎng)料分為1號:木屑98%、蔗糖1%、石膏粉1%;2號:稻草98%、蔗糖1%、石膏粉1%;3號:豆秸稈98%、蔗糖1%、石膏粉1%;4號:玉米秸稈98%、蔗糖1%、石膏粉1%;5號:玉米芯98%、蔗糖1%、石膏粉1%。

1.3 取樣時期

在大球蓋菇生長過程中，分別在接種期、發(fā)菌期、菌絲生長前期、菌絲生長中期、菌絲生長后期、滿桶期、覆土期、原基期、子實體成熟期及間期共10個時期進行取樣。

1.4 粗酶液的提取

在菌絲生長發(fā)育的不同階段，分別在3個重復中取發(fā)菌料充分混勻，然后準確稱取20 g加蒸餾水100 mL，20℃下浸提4 h，過濾，4 000 r·min－1離心5 min，取上清液即為粗酶液。另外同樣稱取20 g發(fā)菌料于熱鼓風干燥箱中80℃烘干至恒重。

1.5 酶活性的測定

羧甲基纖維素酶 (CMC酶)和濾紙纖維素酶 (FP酶)活性測定參照Mandels等[6]的方法;β－葡糖糖苷酶活性測定參照Saswati等[7]的方法;半纖維素酶 (HC酶)活性測定參照Shamala等[8]的方法;漆酶活性測定:向3支樣品管中加入0.5 mL的3.36 mmol·L－1鄰聯(lián)甲苯胺 (用95%的乙醇溶解)作為底物，隨后向4支試管中加入3.4 mL的0.1 mol·L－1乙酸鹽緩沖液 (pH4.6)及0.5 mL粗酶液，置于28℃恒溫水浴鍋中反應30 min，取出后在600 nm處測定吸光值。

漆酶活力單位定義:1 g干培養(yǎng)物中的酶量每分鐘使OD600值改變0.01為1個活力單位。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間CMC酶活性變化

測定不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間CMC酶活性變化，結果見圖1。

由圖1可見，大球蓋菇在不同培養(yǎng)料中均在菌絲生長中期、子實體成熟期產(chǎn)生了酶活性高峰。其中2號和4號培養(yǎng)料中酶活性最強，在菌絲生長中期分別達到了44.8 U和44.5 U。隨后，酶活性急速下降，在產(chǎn)生原基后再次上升，在子實體成熟期達到第2個峰值，其中2號稻草培養(yǎng)料酶活性最高，為39.0 U。1號和5號培養(yǎng)料中CMC酶活性相對較低。

2.2 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間FP酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間FP酶活性變化見圖2。

由圖2可見，不同培養(yǎng)料中大球蓋菇產(chǎn)生的FP酶活性差異較大，但變化趨勢相似。在發(fā)菌期2號培養(yǎng)料中酶活性最大 (35.2 U);在菌絲生長期4號培養(yǎng)料中酶活性達到最大，為42.7 U;在子實體成熟期酶活性再次升高，隨后下降。這說明在發(fā)菌期、菌絲生長期和子實體成熟期纖維素被大量分解利用，間期酶活性下降，菌絲對纖維素的分解能力降低。1號與5號培養(yǎng)料中FP酶活性沒有明顯的波動，酶活性一直較低。

2.3 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間β－葡萄糖苷酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間β－葡萄糖苷酶活性變化情況見圖3。

由圖3可以看出，在大球蓋菇整個栽培過程中，不同培養(yǎng)料中β－葡萄糖苷酶活性趨勢趨于一致，沒有明顯的酶活性高峰和明顯的階段性變化。最大值出現(xiàn)在菌絲生長前期，2號培養(yǎng)料中酶活性達到24.2 U。

2.4 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間HC酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間HC酶活性變化情況見圖4。

由圖4可見，大球蓋菇生長過程中，HC酶分別在菌絲生長前期和子實體成熟期出現(xiàn)了酶活性高峰，其它時期酶活性較低。2號、3號、4號培養(yǎng)料中HC酶活性在菌絲生長前期達到高峰，分別為13.1 U、9.0 U和8.7 U;1號與5號培養(yǎng)料一直保持較低的酶活性。原基形成后各培養(yǎng)料中HC酶活性出現(xiàn)第2個高峰，2號培養(yǎng)料的酶活性最高，達8.7 U。

2.5 不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間漆酶活性變化

不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇期間漆酶活性變化情況見圖5。

由圖5可見，3號培養(yǎng)料在發(fā)菌期漆酶活性迅速上升，而2號、4號培養(yǎng)料中菌絲分泌的胞外漆酶在菌絲生長前期迅速上升，并且與3號培養(yǎng)料在此時期均達到峰值，分別為6.1 U、5.4 U和4.2 U，隨后酶活性迅速下降并一直保持較低水平，直至覆土后出現(xiàn)上升趨勢，在子實體成熟期達到第2個活性高峰，此時稻草培養(yǎng)料中酶活性最高，為5.0 U。1號與5號培養(yǎng)料中酶活性一直較低。

3 討論

大球蓋菇屬于草腐食用菌，人工栽培營養(yǎng)來源主要是從稻草、麥稈、玉米秸稈等培養(yǎng)基質中分解獲得。培養(yǎng)基中的大分子物質主要包括纖維素、半纖維素、木質素等成分。從本試驗結果看出，在大球蓋菇生長的全過程中均能測出胞外CMC酶、FP酶、β－葡萄糖苷酶、HC酶和漆酶活性。這些胞外酶是分解培養(yǎng)基中大分子物質的生理生化基礎，尤其是在以木質纖維素為主要營養(yǎng)來源的環(huán)境中賴以生存的保證。大球蓋菇生料栽培期間，不同的栽培基質中各個酶的活性變化規(guī)律基本一致，除了β－葡萄糖苷酶活性無明顯變化外，其他酶均在菌絲生長期和子實體發(fā)育期活性較高，這與菌絲生長和子實體發(fā)育需要大量營養(yǎng)有關。CMC酶與FP酶在菌絲生長中期和子實體成熟期酶活性最高，HC酶與漆酶在菌絲生長前期和子實體成熟期酶活性最高。HC酶是水解半纖維素的酶，漆酶是水解木質素的主要酶類，在高等植物中，木質素和半纖維素一起包圍著纖維素，對纖維素有物理性的屏障作用[9]，在木質纖維素降解過程中會首先分解半纖維素和木質素，因此HC酶和漆酶先達到酶活性高峰，之后出現(xiàn)纖維素酶活性高峰，這與一些學者對平菇、金頂側耳、姬松茸、滑菇、灰樹花、香菇等的研究結果相似但也存在差異[10－14]。平菇等食用菌的胞外酶活性在子實體成熟期遠高于菌絲生長期，而大球蓋菇菌絲生長期間胞外酶活性略高于子實體成熟期，可能是由于大球蓋菇采用的是生料栽培，而其他食用菌采用的是發(fā)酵料栽培或者熟料栽培的原因。

綜合幾種酶的變化趨勢可以看出，在菌絲生長期和子實體發(fā)育期酶活性較高，其它時期酶活性較低，說明菌絲生長期和子實體發(fā)育期是大球蓋菇分解培養(yǎng)基質、吸收營養(yǎng)的2個主要時期;從酶活性角度看，稻草、玉米秸稈和豆秸稈培養(yǎng)基質中酶活性較高，利用不同培養(yǎng)料栽培大球蓋菇的產(chǎn)量以及與胞外酶之間的關系有待進一步研究。

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