王穎立 牛膺筠
近年的研究發(fā)現(xiàn)年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)的病理改變[1]與脈絡膜和玻璃膜上的基質金屬蛋白酶(metrix metalloproteinases,MMPs)和基質金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)水平的改變密切相關[2]。
眾所周知,視網(wǎng)膜光損傷是研究視網(wǎng)膜變性類疾病(例如AMD)的良好動物模型[3]。因此本研究通過建立小鼠光損傷動物模型,著重觀察視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞中金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)及細胞外信號調節(jié)激酶蛋白1(extracellular regulated proteinkinase-1,ERK-1)表達的變化,同時應用重組人促紅細胞生成素(recombination human erythropoietin,rhEPO)進行小鼠腹腔注射,檢測其產(chǎn)生的影響,以進一步完善我們對EPO視網(wǎng)膜神經(jīng)保護作用的認識,從而為AMD的治療尋求新的思路和方法。
1.1 材料
1.1.1 動物與分組 健康成年近交系 BALB/c小鼠52只(104眼),4周齡,體質量18 g左右,購自山東醫(yī)科大學動物實驗中心,雄性,動物基因背景為Rpe65 450Leu450,對光損傷具有高度敏感性。嚴格遵守SPF級小鼠喂養(yǎng)條件。實驗動物及實驗使用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》。將動物隨機分為單純光照組(24只)、EPO處理組(24只)和正常對照組(4只)。其中前兩組按光照后處死時間的不同又分為6 h、12 h、36 h、72 h、96 h和7 d 6個亞組,每個亞組各4只8眼。
1.1.2 主要試劑 TIMP-1兔 IgG多抗、ERK-1羊IgG多抗(美國 Santa Cruz公司),封閉血清、復合消化液、PV6001免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒、APES黏片劑(北京中山生物技術有限公司),生物素化兔抗山羊抗體(武漢博士德生物技術有限公司),3000 U·mL-1rhEPO(沈陽三生制藥公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗前準備 將單純光照組和EPO處理組小鼠在12 h明/12 h暗的循環(huán)光照環(huán)境中喂養(yǎng)10 d,暗適應10 h。
1.2.2 動物模型及給藥 采用自制光照箱建立大鼠光損傷模型(光照箱由中國海洋大學光學研究室研制),單純光照組小鼠光照前1 h在紅光下用托品酰胺眼液散瞳,共2~3次后,置于6000 Lux光照箱中照射4 h;EPO處理組小鼠光照前2 h腹腔注射rhEPO,劑量為5000 U·kg-1,再散瞳置于同樣條件光照箱中照射4 h。光照過程中,實驗人員戴防護墨鏡注視小鼠,當觀察到小鼠閉瞼時立刻敲動光照箱防止其閉瞼。光照后將小鼠置于暗室中喂養(yǎng),并分別于光照后6 h、12 h、36 h、72 h、96 h 及7 d 將動物處死。
1.2.3 標本的取材、固定與切片 將小鼠用頸椎脫臼法處死即刻摘除眼球,脫水、固定。將石蠟包埋好的眼球標本,以平行于視神經(jīng)矢狀軸為平面進行連續(xù)切片,厚約4 μm。
1.2.4 HE染色 石蠟切片徹底脫蠟、水化,蘇木素染色5 min,氨水返藍30 s,伊紅染色30 s,脫水、透明,中性樹膠封片[4];觀察RPE細胞形態(tài)學變化。
1.2.5 免疫組織化學染色 烤片、脫蠟、水化,加體積分數(shù)3%H2O21滴,10 min后水洗、擦片;切片加1滴或者50 μL非免疫動物血清,放入濕盒10 min;切片加1滴或者50 μL一抗,濕盒內4℃冰箱過夜;PBS沖洗,振蕩;切片加1滴或者50 μL PV6001,37℃孵育30 min,PBS沖洗;DAB溶液顯色,自來水終止反應,流水沖洗2~3 min;蘇木素復染15~20 s,自來水沖洗;酒精脫水、透明、中性樹膠封片。
1.3 結果觀察與數(shù)據(jù)處理 在光學顯微鏡下,TIMP-1、ERK-1蛋白陽性表達均為棕黃色,位于RPE細胞胞漿。陰性細胞經(jīng)蘇木素復染后,RPE細胞呈藍色或淺藍色。每只眼球取兩張切片,應用Imagepro plus圖像分析系統(tǒng)對免疫組織化學切片進行圖像分析(每張切片取4個視野,以視神經(jīng)為基準分別向兩側各取2個視野),計算每組8個眼球的平均OD值,作為陽性細胞的平均OD值,從而對RPE細胞中TIMP-1和ERK-1蛋白表達進行相對定量分析。
2.1 HE染色結果
2.1.1 形態(tài)學觀察 正常對照組 BALB/c小鼠視網(wǎng)膜結構層次分明,視桿細胞內、外節(jié)排列整齊規(guī)則,分界清晰;外核層排列緊密,染色均勻,RPE細胞呈單線狀排列,細胞形態(tài)規(guī)整(圖1)。
單純光照組光照后6 h,視網(wǎng)膜桿狀細胞外節(jié)輕微空泡變性,其余各層未見明顯改變;光照后12 h,桿狀細胞內、外節(jié)排列稍紊亂,外核層變薄,RPE細胞排列疏松;光照后36 h,內、外節(jié)排列紊亂,分界不清,外核層明顯變薄,細胞間隙加大,出現(xiàn)核濃染及一些不規(guī)則細胞核,RPE細胞明顯腫脹、邊界不清、形態(tài)不規(guī)則;光照后7 d,內、外節(jié)出現(xiàn)大的空泡樣變性,外核層部分消失,僅殘留少量破碎的細胞核,RPE細胞出現(xiàn)丟失、雙層現(xiàn)象(圖2)。
EPO處理組,小鼠視網(wǎng)膜組織學改變較晚發(fā)生且不明顯,光照后6 h和12 h,未見明顯改變;光照后36 h,內、外節(jié)出現(xiàn)輕度空泡樣變,RPE細胞出現(xiàn)輕度腫脹;光照后7 d,內、外節(jié)排列稍紊亂,外核層細胞間間隙加大,未見明顯RPE細胞丟失、雙層現(xiàn)象。
2.1.2 RPE細胞密度變化 正常對照組RPE細胞密度為(1.61±0.22)mm-2;隨光照后時間延長,單純光照組RPE細胞密度逐漸減少(表1),光照后7 d RPE細胞密度與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。光照后相同時間點,EPO處理組的RPE細胞密度較單純光照組稍有增加,光照后7 d二者差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
Figure 1 Normal mouse retinal tissue and RPE(arrow,HE,×400).Figure 2 RPE cell disappeared and RPE layer doubledecked at 7 days after irradiation in simple irradiation group(HE,×400) 圖1 正常對照組小鼠視網(wǎng)膜組織以及RPE形態(tài)(箭頭,HE,×400)。圖2 單純光照組光照后7 d RPE細胞出現(xiàn)丟失、雙層現(xiàn)象(HE,×400)
表1 光照后不同時間點單純光照組和EPO處理組RPE細胞密度變化Table 1 Changes of RPE cell density at different time after irradiation in two groups(cell density/cell·mm -2)
2.2 免疫組織化學染色
2.2.1 ERK-1免疫組織化學染色 ERK-1蛋白陽性表達為棕黃色,位于RPE細胞的胞漿。正常對照組視網(wǎng)膜組織無ERK-1陽性表達(圖3)。單純光照組:不同光照時間點,與正常對照組中RPE的ERK-1表達差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。EPO處理組:從光照后6 h起,各亞組均可見到陽性表達細胞,且隨光照后時間的推移,陽性表達呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢,光照后72 h表達強度達到高峰(圖4),光照后7 d ERK-1陽性表達強度較前降低(表2);EPO處理組與正常對照組差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。光照后各個時間點,EPO處理組均較單純光照組中ERK-1的表達明顯增強(均為P<0.05,見表2)。
2.2.2 TIMP-1免疫組織化學染色 TIMP-1蛋白陽性表達為棕黃色,主要表達于RPE細胞的胞漿。正常對照組RPE細胞中可以檢測到少量棕黃色染色,即TIMP-1弱陽性表達,OD值為23.75±5.75。單純光照組:光照后各時間點RPE層TIMP-1陽性表達與正常對照組相比無明顯變化(均為P>0.05)。EPO處理組:光照后6 h,RPE層開始出現(xiàn)明顯TIMP-1陽性表達,隨著光照后時間的推移,陽性RPE細胞棕黃色染色強度遞增,光照后96 h TIMP-1表達強度達到高峰,而后TIMP-1在RPE層表達降低(表3)。
光照后6 h、7 d,單純光照組和 EPO處理組中TIMP-1的表達差異均無統(tǒng)計學意義(均為 P>0.05),自光照后12 h起至光照后96 h,各時間點EPO處理組較單純光照組中TIMP-1的表達增強(均為P <0.05,見表3)。
Figure 3 No ERK-1 expression in normal rat retinal tissue(×400).Figure 4 ERK-1 expression in RPE cell was increased at 72 hours after irradiation in EPO treated group(×400) 圖3 正常對照組小鼠視網(wǎng)膜組織無ERK-1表達(×400)。圖4 EPO處理組光照后72 h視網(wǎng)膜RPE細胞ERK-1表達明顯增強(×400)
表2 光照后不同時間點RPE細胞ERK-1表達變化的情況Table 2 Expression of ERK-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD,)
表2 光照后不同時間點RPE細胞ERK-1表達變化的情況Table 2 Expression of ERK-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD,)
Note:SL:Simple light-induced group;ET:EPO treated group;Compared with control group,bP <0.05,cP <0.01
t P 6 hours 8 3.91±1.02 10.09±5.76b Time Case SL ET-2.988 2 <0.05 12 hours 8 4.25±1.11 33.15±3.32b-23.350 4 <0.05 36 hours 8 5.02±0.57 39.16±4.04c-23.667 2 <0.05 72 hours 8 3.76±2.90 49.22±3.93c-26.326 0 <0.05 96 hours 8 4.83±1.08 42.83±4.83c-21.716 4 <0.05 7 days 8 3.86±0.81 28.75±2.38c-28.002 3 <0.05
表3 光照后不同時間點RPE細胞TIMP-1的表達變化Table 3 Expression of TIMP-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD,)
表3 光照后不同時間點RPE細胞TIMP-1的表達變化Table 3 Expression of TIMP-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD,)
Note:Compared with control group,bP <0.05,cP <0.01(one-way ANOVA,Dunnett t test)
Time Case SL ET t P 6 hours 8 20.50±3.79 22.93±3.80 1.280 6 0.221 1 12 hours 8 26.25±5.36 31.05±3.22b 2.171 2 0.047 6 36 hours 8 25.62±7.57 38.16±4.04c 4.133 3 0.000 5 72 hours 8 26.59±8.45 42.62±4.93c 4.634 5 0.000 2 96 hours 8 24.83±5.08 48.83±7.83c 7.272 9 0.000 0 7 days 8 18.86±3.81 18.75±7.38c 0.037 5 0.970 6
2.2.3 TIMP-1與 ERK-1相關性 EPO處理組中TIMP-1的表達與 ERK-1的水平直線相關(圖5)。EPO處理組RPE中TIMP-1的表達與ERK-1的表達正相關(r=0.79,P=0.03)。
Figure 5 Relationship scatterplot between TIMP-1 and ERK-1 expressions in RPE cell in EPO treated group EPO處理組RPE細胞中TIMP-1與ERK-1表達相關性分析散點圖
EPO是一種主要影響紅細胞生成的細胞因子,在臨床試驗中應用rhEPO可以模擬內源性EPO在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多種作用。在視網(wǎng)膜缺血、缺氧損傷中,rhEPO也表現(xiàn)出相應的神經(jīng)保護和促神經(jīng)細胞生長的作用[5]。以往的研究中[6],發(fā)現(xiàn) rhEPO 腹腔注射后可通過小鼠血-視網(wǎng)膜屏障進入視網(wǎng)膜組織,并且可以有效抑制視網(wǎng)膜感光細胞凋亡,證明外源性EPO具有抑制光損傷造成的視網(wǎng)膜感光細胞凋亡的作用。本實驗中EPO處理組小鼠RPE細胞組織學光損傷改變較晚發(fā)生且不明顯,也進一步證實了這一結論。但是EPO到底是通過什么樣的機制抑制了視網(wǎng)膜細胞的凋亡尚不清楚。
MMPs是參與細胞外基質降解的內源性蛋白水解酶。TIMPs是MMPs的內源性抑制劑,共有4種,其中TIMP-1廣泛分布于組織和體液中[7]。在正常生理狀態(tài)下,TIMPs與MMPs協(xié)同產(chǎn)生,維持動態(tài)平衡,在組織重建、腫瘤細胞遷移、血管生成、傷口愈合等過程中發(fā)揮關鍵作用。但是當這種平衡被打破時,可導致各種疾病和促進疾病的惡化。
RPE是血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分,體外培養(yǎng)的RPE細胞能分泌 MMPs和 TIMPs[8]。AMD病變過程中MMPs/TIMPs平衡的改變可能與RPE分泌作用的變化密切相關。因此本研究中,我們將RPE細胞隨著光損傷后時間的延長TIMP-1表達的變化作為觀察的重點。在研究中發(fā)現(xiàn),光照后隨時間延長,EPO處理組中TIMP-1較單純光照組表達明顯增強。這證明外源性的EPO可以增加RPE細胞TIMP-1的表達。
TIMP-1的主要功能是對 MMP-2、MMP-9的抑制作用,調節(jié)細胞外基質的代謝;同時還在細胞生長、繁殖、凋亡及刺激血管生成等生理和病理學方面發(fā)揮一定的作用[9]。因此我們考慮,小鼠視網(wǎng)膜光損傷后,給予外源性的EPO,RPE細胞TIMP-1的表達增加可能發(fā)揮以下幾方面作用:(1)可以與增多的MMP-2、MMP-9相拮抗,抑制其過強的細胞外基質降解作用,促進瘢痕的生成,重建MMPs/TIMPs二者的平衡狀態(tài),維持玻璃膜正常的結構、功能和視網(wǎng)膜光感受器正常的生理功能。(2)TIMP-1可以活化c-Src、PI3-K、Akt等抗凋亡因子,發(fā)揮其抗細胞凋亡的作用[10],抑制光損傷造成的感光細胞、RPE等的凋亡。(3)通過影響內皮細胞的趨化性,抑制新生血管生成過程中的內皮細胞遷移[11],從而抑制視網(wǎng)膜脈絡膜新生血管的生成。以上這些作用還需要進一步實驗證實??傊覀兛梢哉J為外源性EPO發(fā)揮對視網(wǎng)膜光損傷的保護作用可能與增加RPE細胞TIMP-1的表達有關。
此外,本研究還發(fā)現(xiàn),EPO處理組從光照后6 h起,各亞組均可見到ERK-1陽性表達的RPE細胞,且隨光照后時間的推移陽性表達呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢,光照后72 h表達強度達到高峰,并且 ERK-1表達增高的趨勢與TIMP-1直線相關。因此推測,EPO引起的TIMP-1的分泌和表達可能經(jīng)由MAPK途徑。
總之,視網(wǎng)膜光損傷過程中MMPs/TIMPs平衡破壞的發(fā)現(xiàn),為AMD等與光照損傷有關的疾病的研究打開了一個新的視窗。EPO對RPE細胞TIMP-1分泌調節(jié)作用的證實,也為我們進一步分析EPO發(fā)揮視網(wǎng)膜光損傷保護作用的機制提供了依據(jù)。
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