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    聯合免疫失敗過程中乙型肝炎病毒S基因突變的母嬰配對研究*

    2014-11-08 02:28:08張培珍尹玉竹侯紅瑛
    中國病理生理雜志 2014年9期
    關鍵詞:突變率基因突變月齡

    張培珍, 尹玉竹, 鄧 妮, 周 瑾, 侯紅瑛

    對感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的孕婦所分娩的新生兒進行乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗主、被動聯合免疫,成功率高達95%以上[1],但仍有免疫失敗的發(fā)生。免疫失敗除與高病毒載量有關外,也與HBV發(fā)生基因突變尤其是 S基因區(qū)(包括前S和S區(qū))突變所致的免疫逃逸株(vaccine escape mutant,VEM)有關[2-4]。多項研究發(fā)現經聯合免疫但發(fā)生免疫失敗的兒童體內HBV的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)編碼區(qū)基因突變率明顯高于無免疫人群[5]。VEM是發(fā)生在聯合免疫前源自于母親,還是聯合免疫后源自于選擇壓力,文獻報道不一[6-7],且大多數研究未將母親、新生兒和嬰幼兒作對比,存在選擇偏倚。因此,本研究選擇分娩免疫失敗嬰兒的孕婦及其聯合免疫前的新生兒和已完成了聯合免疫的7月齡嬰兒,將母親、新生兒和嬰兒分別配對,對比其HBV S基因突變的不同,以探討免疫失敗過程中HBV S基因突變的發(fā)生率、發(fā)生階段和突變特征。

    材料和方法

    1 研究對象

    選擇2008年6月~2011年3月在廣州市中山大學附屬第三醫(yī)院定期產檢、住院分娩和隨訪的血清HBsAg陽性孕婦及其所分娩的嬰兒。孕婦入選標準:年齡≥20歲;孕周28~42周;HBsAg陽性;HBV DNA≥1×1010IU/L;無嚴重肝功能異常;血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系檢查呈陰性;孕期未使用抗病毒藥物、免疫調節(jié)劑和細胞毒性藥物,無長期使用糖皮質激素類藥物;丈夫系非HBsAg陽性者;B超排除胎兒畸形。排除標準:未能在出生24 h內及時進行主被動聯合免疫接種的新生兒及其母親。

    2 研究方法

    孕婦在分娩前24 h內留取靜脈血2 mL;新生兒于出生6 h內盡早肌肉注射乙肝免疫球蛋白200 IU,并按0、1、6方案接種重組酵母乙肝疫苗10 μg,分別于出生時聯合免疫前以及7月齡時采集嬰兒外周靜脈血檢測 HBV 標志物(HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc)及HBV DNA定量,并各留取2 mL靜脈血備用。以新生兒出生時HBsAg和(或)HBV DNA陽性并持續(xù)至7月齡作為免疫失敗標準[8],研究期間共觀察到15例嬰兒發(fā)生免疫失敗,分娩免疫失敗嬰兒的孕婦、新生兒和已完成免疫接種的7月齡嬰兒分別構成母親組(15例)、新生兒組(15例)和嬰兒組(15例),對比3組間HBV基因型、S基因(包括前S和S)突變率及突變位點的不同。

    3 方法

    3.1 病毒DNA擴增及鑒定 采用PCR擴增直接測序法進行HBV前S/S基因檢測。因前S/S基因較大,將其分為2個片段分別進行PCR擴增,片段1:含部分前S及部分S區(qū),上、下游引物分別為5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3′和 5′-GGACAAACGGGCAACATACC-3′;片段2:含“a”決定簇及周圍部分S區(qū),上、下游引物分別為 5′-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTAT-3′和 5′-TGCGTCAGCAAACACTTGGC-3′,2 個片段長度均為800 bp左右。PCR擴增采用ABI 2700擴增儀,擴增條件如下:95℃ 變性5 min,隨后45個循環(huán)(94℃ 30 s,55.5℃ 30 s,72℃ 50 s);最后于 72℃延伸10 min。采用含0.5 kg/L溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR擴增產物。以DNA標志物M1200-50(北京索萊寶科技有限公司)為DNA片段條帶大小及濃度標準品,采用凝膠成像分析系統(tǒng)UVP GDS-8000分析PCR擴增的片段長度。將所得片段送上海英濰捷基公司進行DNA測序。

    3.2 基因序列同源性及突變位點分析 從GenBank隨機下載中國廣東省的HBV基因全序列8條作為參考序列(AY817515.1、DQ448628.1、DQ478896.1、DQ478899.1、DQ478901.1、NC003977.1、Y18858.1和AY217370.1)。采用Chromas軟件評估測序結果,DNAMAN軟件比對DNA序列,以S基因區(qū)的突變位點進行HBV基因分型[9],并利用距離法構建同源樹進行同源性分析,根據既往已發(fā)表文獻,尋找所得序列中可能與聯合免疫失敗相關并且在3組間有不同的突變位點。

    4 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,數據以均數±標準差(mean±SD)表示,定量資料采用t檢驗及秩和檢驗;定性資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 同源性分析

    母親、新生兒和嬰兒3組中除2例新生兒樣本因HBV DNA定量過少導致PCR擴增失敗外,其余43例均成功測序,對比3組HBV前S/S基因的測序結果,15例母親與所分娩的新生兒和嬰兒體內HBV的基因型及亞型完全相同,其中B基因型12例,C基因型3例。對片段1和片段2分別進行同源樹簇集分析,15例母親與所分娩的新生兒及嬰兒體內HBV所測序列均各自形成獨立的簇集,簇集內同源性為(99~100)%。

    2 突變率

    片段1和片段2的突變率3組間比較(Kruskal-Wallis檢驗),差異均無統(tǒng)計學意義,見表1。

    表1 母親、新生兒和嬰兒體內HBV前S/S基因2個片段突變率的比較Table 1.Comparison of mutation rates of the 2 fragments in HBV pre-S/S gene among mothers,newborns and infants[Median(Q1~Q3)]

    3 突變位點

    3.1 母親-新生兒(13對)7例新生兒與母親體內的HBV存在不同的突變位點(共15個位點),其中有4例母親體內HBV發(fā)生的某些突變(9個位點)沒遺傳給新生兒,4例新生兒出現母親所沒有的新發(fā)突變(5個位點),這4例中有2例既沒有遺傳母親的突變,又同時出現了新發(fā)突變,見表2。

    3.2 新生兒-嬰兒(13對) 僅3例嬰兒出現不同于新生兒的突變位點(共3個位點),即nt273A→A/G、nt512C→C/T、nt1139C→A,前2個發(fā)生在S區(qū),并在a決定簇之外,ntC1139C→A則發(fā)生在與X編碼框重疊的區(qū)域,見表2。

    3.3 嬰兒-母親(15對) 有9例嬰兒出現不同于母親的突變位點(共25個位點),其中5例嬰兒與新生兒相同,1例母親與新生兒相同,2例因新生兒樣本擴增失敗而無法和新生兒比較,僅1例在母親、新生兒和免疫后的嬰兒中均有不同,見表2。

    討 論

    HBV S基因區(qū)分為前 S和S區(qū),與HBV基因分型密切相關。前 S區(qū)含有HBV免疫調理的作用位點和肝細胞的結合位點,含前S顆粒的疫苗在小鼠中的免疫效果明顯優(yōu)于不含前S顆粒的疫苗;S區(qū)編碼HBsAg,其第124~147位氨基酸為“a”抗原決定簇,是宿主對HBV進行體液免疫最重要的抗體結合位點。前S區(qū) 基因突變可導致免疫逃避[10]及HB-sAg與 HBsAb共存[11]。S區(qū)基因突變可使 HBsAg發(fā)生氨基酸替代,使抗體的中和作用無法進行,從而形成VEM[2]。研究認為與HBV母嬰傳播免疫失敗有關的VEM主要出現在兩個階段:(1)聯合免疫前:主要源于母親被VEM水平感染和/或體內HBV自發(fā)突變形成 VEM,并通過垂直傳播給新生兒,Ghosh等[12]在未接種乙肝疫苗的乙肝患者體內發(fā)現VEM;(2)聯合免疫后:新生兒體內的HBV在聯合免疫壓力下發(fā)生基因突變,形成VEM[2]。要明確VEM的發(fā)生階段必須將母親、新生兒以及免疫接種后的嬰幼兒進行對比,我們對比了未進行聯合免疫前的新生兒、母親以及免疫失敗后的7月齡嬰兒體內的 HBV,研究S基因突變的發(fā)生階段和突變特征,為今后在相應階段采取適當的防治措施,減少VEM的出現,進一步降低HBV的母嬰傳播提供分子生物學依據。

    表2 母親、新生兒和嬰兒體內HBV前S/S基因突變位點的比較Table 2.Comparison of mutation sites in HBV pre-S/S gene among mothers,newborns and infants

    本研究中15例發(fā)生免疫失敗的7月齡嬰兒和新生兒體內HBV的基因型及亞型與母親完全相同,3組在HBV前S/S基因突變率相比也無統(tǒng)計學差異,在同源樹簇集分析中,每對母親與所分娩的新生兒及嬰兒體內的HBV均形成各自獨立的簇集,提示新生兒及嬰兒體內的HBV與母親同源;即新生兒及免疫后嬰兒體內的HBV均源于母親垂直傳播,與目前研究相符[13]。

    對母親-新生兒體內HBV前S/S基因突變的配對分析(聯合免疫前階段),提示2組突變率雖無顯著差異(P>0.05),但卻存在著不同的突變位點,母親體內HBV發(fā)生的某些突變并不遺傳給新生兒,與既往研究相似,即HBV的傳播具有選擇性[14]。同時新生兒也出現一些母親所沒有的新發(fā)突變。研究認為野生病毒株面對選擇性壓力時,部分病毒株會出現一些新發(fā)突變以適應當前的環(huán)境[7,14]。在本研究中,新生兒體內HBV的新發(fā)突變可能就是選擇性壓力下的一種適應性的反應,并在新生兒宿主環(huán)境的壓力下逐漸積累形成優(yōu)勢病毒株,適應新生兒體內環(huán)境,進而導致HBV母嬰傳播免疫失敗。而既往研究多直接將母親與免疫失敗后嬰幼兒體內的HBV病毒株進行比對,未與新生兒比對,忽略了母親體內HBV垂直傳播給新生兒過程中存在選擇性壓力導致的突變問題,而將此類突變歸于聯合免疫壓力,假陽性率偏高。

    目前對HBV前S/S區(qū)基因突變與聯合免疫的相關性研究差異較大。有研究發(fā)現應用乙肝疫苗可使HBV S基因發(fā)生突變,導致表面蛋白的改變[15],產生 VEM,可導致已免疫人群的感染[2]。Hsu等[5]研究也認為,經過聯合免疫的兒童體內的HBV基因突變率明顯高于未免疫的兒童。而Basuni等[6]對比聯合免疫與無聯合免疫兒童體內HBV S區(qū)“a”決定簇的基因突變位點,并無明顯差異,認為這些突變源于自然的變異,而非聯合免疫所致。另有學者認為HBV感染可能與宿主免疫功能低下有關,而非基因突變所致[16]。在本研究中,15例完成聯合免疫但免疫失敗的嬰兒與免疫前新生兒體內的HBV對比,僅3例出現不同的突變,突變位點(3個)較少,很難判斷是否為聯合免疫所致,并且在3個突變中雖2個發(fā)生在S區(qū),可影響第41位及第162位氨基酸合成,但位于“a”決定簇之外,因此與免疫逃逸應無直接相關性。nt1166dupC發(fā)生在與X編碼框重疊的區(qū)域,有研究認為HBx蛋白可降低胰島素樣生長因子Ⅱ基因P4啟動子甲基化水平,進而上調其轉錄表達[17],是否影響母嬰垂直傳播尚不明確。因此,以上突變是否由聯合免疫壓力造成,還是源于自發(fā)突變,以及是否會對免疫失敗造成影響均需進一步觀察。

    本研究也進行了嬰兒-母親之間的配對分析,發(fā)現2組的突變率并無差異(P>0.05),雖有9例嬰兒與母親體內HBV存在不同的突變位點,除去2例新生兒樣本擴增失敗的病例,5例嬰兒是與新生兒相同的,1例母親與新生兒相同,僅1例在母親、新生兒及免疫后嬰兒均存在不同的突變位點,同源樹分析也提示免疫后嬰兒體內的HBV仍源自母親。與既往研究結果差異較大,考慮主要是因為既往研究多直接將母親與免疫后不同年齡兒童體內的HBV對比,忽略了隨時間推移兒童體內的HBV可自發(fā)突變以及水平再感染的可能,而將此類突變都歸于聯合免疫壓力所致,假陽性較高。本研究選擇完成全程免疫接種后1個月,即7月齡的嬰兒,并和母親以及免疫前的新生兒作對比,減少了時間的影響和選擇偏倚,提高了研究的可靠性。本研究也存在不足,有2例新生兒樣本擴增失敗,而其母親和7月齡嬰兒均發(fā)現多個不同的突變位點,影響了研究結果的準確性。

    綜上所述,HBV在母親-新生兒-嬰幼兒的傳播過程中,新生兒及免疫后嬰兒體內的HBV病毒株均源自于母親;在聯合免疫前和免疫后均可發(fā)生突變,主要發(fā)生在聯合免疫前,且以選擇壓力為主,是否與免疫失敗有關尚需進一步研究。

    [1] Ni YH,Huang LM,Chang MH,et al.Two decades of universal hepatitis B vaccination in taiwan:impact and implication for future strategies[J].Gastroenterology,2007,132(4):1287-1293.

    [2] Clements CJ,Coghlan B,Creati M,et al.Global control of hepatitis B virus:does treatment-induced antigenic change affect immunization?[J].Bull World Health Organ,2010,88(1):66-73.

    [3] Luo Z,Li L,Ruan B.Impact of the implementation of a vaccination strategy on hepatitis B virus infections in China over a 20-year period[J].Int J Infect Dis,2012,16(2):e82-e88.

    [4] Su H,Zhang Y,Xu D,et al.Occult hepatitis B virus infection in anti-HBs-positive infants born to HBsAg-positive mothers in China[J].PLoS One,2013,8(8):e70768.

    [5] Hsu HY,Chang MH,Ni YH,et al.No increase in prevalence of hepatitis B surface antigen mutant in a population of children and adolescents who were fully covered by universal infant immunization[J].J Infect Dis,2010,201(8):1192-1200.

    [6] Basuni AA,Butterworth L,Cooksley G,et al.Prevalence of HBsAg mutants and impact of hepatitis B infant immunisation in four Pacific Island countries[J].Vaccine,2004,22(21-22):2791-2799.

    [7] Xu H,Peng M,Qing Y,et al.A Quasi species of the pre-S/S gene and mutations of enhancer II/core promoter/pre-C in mothers and their children infected with hepatitis B virus via mother-to-infant transmission[J].J Infect Dis,2006,193(1):88-97.

    [8] Su HX,Zhang YH,Zhang ZG,et al.High conservation of hepatitis B virus surface genes during maternal vertical transmission despite active and passive vaccination[J].Intervirology,2011,54(3):122-130.

    [9] Lindh M,Andersson AS,Gusdal A.Genotypes,nt 1858 variants,and geographic origin of hepatitis B virus:largescale analysis using a new genotyping method[J].J Infect Dis,1997,175(6):1285-1293.

    [10]Shen T,Yan XM,Zou YL,et al.Virologic characteristics of hepatitis B virus in patients infected via maternal-fetal transmission[J].World J Gastroenterol,2008,14(37):5674-5682.

    [11] Huang X,Qin Y,Zhang P,et al.PreS deletion mutations of hepatitis B virus in chronically infected patients with simultaneous seropositivity for hepatitis-B surface antigen and anti-HBS antibodies[J].J Med Virol,2010,82(1):23-31.

    [12] Ghosh S,Banerjee P,Roychoudhury A,et al.Unique hepatitis B virus subgenotype in a primitive tribal community in eastern India[J].J Clin Microbiol,2010,48(11):4063-4071.

    [13] Kim HS,Choi BY,Choi HS,et al.Phylogenetic analyses of HBV pre-S/S genes in mother-child pairs with long-term infection by presumed vertical transmission[J].J Korean Med Sci,2014,29(4):564-569.

    [14]Domingo E,Ruiz-Jarabo CM,Sierra S,et al.Emergence and selection of RNA virus variants:memory and extinction[J].Virus Res,2002,82(1-2):39-44.

    [15]Theamboonlers A,Chongsrisawat V,Jantaradsamee P,et al.Variants within the“a”determinant of HBs gene in children and adolescents with and without hepatitis B vaccination as part of Thailand′s Expanded Program on Immunization(EPI)[J].Tohoku J Exp Med,2001,193(3):197-205.

    [16]高月求,孫學華,章曉鷹,等.乙肝病毒蛋白對慢性乙型肝炎患者PBMCs功能的影響[J].中國病理生理雜志,2007,23(6):1161-1163.

    [17]湯紹輝,張良鵬,吳小娟,等.乙型肝炎病毒X蛋白通過降低P4啟動子甲基化水平上調人IGF-Ⅱ基因的轉錄[J]. 中國病理生理雜志,2012,28(9):1633-1638.

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