DADLE對(duì)大鼠急性全腦缺血再灌注繼發(fā)肺損傷的作用*

黃偉青， 劉升明， 武 釗， 鄭埕斌， 郭 偉， 梁 慶

急性全腦缺血為急診醫(yī)學(xué)常見(jiàn)急癥之一，主要病因?yàn)榧毙阅X卒中，心臟驟停(猝死)、顱腦創(chuàng)傷等。及時(shí)予以再灌注是治療的關(guān)鍵，但腦血流的恢復(fù)除可能對(duì)正常或缺血的腦組織產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙外，還可誘發(fā)遠(yuǎn)隔重要臟器的損傷［1］。根據(jù)病灶大小、病變部位和受損程度的不同，可有不同程度的心臟或(和)肺臟損害的表現(xiàn)，嚴(yán)重者常危及患者生命。目前報(bào)道較多的是對(duì)心臟(腦心綜合征)的繼發(fā)損害研究［2］，而對(duì)繼發(fā)肺損傷的研究報(bào)道較少。目前抑制再灌注損傷及保護(hù)繼發(fā)臟器損傷成為治療急性腦缺血再灌注的主要環(huán)節(jié)，但用于臨床且有明確療效的靶向藥物尚缺乏。

DADLE(D-Ala2-D-Leu5-enkephalin)的分子式為C29H39N507，作為被克隆的一種G蛋白偶聯(lián)受體，是目前國(guó)外研究較為深入的δ阿片受體激動(dòng)劑。近年來(lái)在國(guó)外對(duì)DADLE保護(hù)缺血再灌注臟器方面有較多研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DADLE可以提高組織氧利用率及維持組織氧代謝平衡從而減輕組織缺氧造成的能量代謝紊亂，減少細(xì)胞和組織的損傷［3］。本研究通過(guò)改良的二血管阻斷加低血壓法建立大鼠急性全腦缺血再灌注模型，于再灌注前經(jīng)由左側(cè)頸靜注射DADLE進(jìn)行干預(yù)，在光鏡和電鏡下觀察肺損傷情況，通過(guò)檢測(cè)肺損傷超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛 (malondialdehyde，MDA)含量的變化，評(píng)估其對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雌性SD大鼠30只，體重180～220 g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)，由專人單籠飼養(yǎng)，明暗周期12 h，自由取食(喂以商用鼠飼料)和飲水，房間溫度25℃左右，濕度50%左右。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào):SYXK(粵)2010-0104，許可證號(hào) SCXK(粵)2013-0002。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后大鼠隨機(jī)分為3組:包括假手術(shù)(sham)組、模型(I/R)組和DADLE處理組，每組10只。

2 試劑與儀器

δ阿片受體激動(dòng)劑DADLE和戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma;低分子肝素注射液購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司;SOD檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所研制。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 二血管阻斷加低血壓建立大鼠全腦缺血再灌注模型的建立 取禁食12 h的SD大鼠，先用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位綁在大鼠固定板上，之后每小時(shí)追加2%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)維持麻醉狀態(tài)。左側(cè)腹股溝區(qū)消毒備皮，剪開(kāi)腹股溝處皮膚，分離左側(cè)股動(dòng)脈后采用靜脈留置針行動(dòng)脈插管，右側(cè)股動(dòng)脈以相同的方法行動(dòng)脈插管。利用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)記錄動(dòng)脈血壓。頸部備皮，頸部正中剪開(kāi)皮膚，用彎鑷自氣管旁肌肉和胸鎖乳突肌之間鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈，穿線備用，注意避免損傷迷走神經(jīng)。在左側(cè)股動(dòng)脈留置針?lè)执畏叛寡獕罕３衷?0～40 mmHg，觀察動(dòng)物呼吸，維持呼吸平穩(wěn)，微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，腦電圖波形保持平直時(shí)為腦缺血成功的標(biāo)志，在缺血15 min末解除動(dòng)脈夾，同時(shí)通過(guò)股動(dòng)脈分次回輸血液進(jìn)行再灌注至血壓達(dá)到正常水平。再灌注期時(shí)間為120 min。經(jīng)左側(cè)頸靜脈插管建立體外給藥途徑。DADLE處理組為再灌注前頸靜脈注射5 mg/kg的DADLE。Sham組除不做血管夾閉、不抽血和不給藥外，其余操作與模型組相同。

3.2 肺組織病理學(xué)的檢測(cè) 光學(xué)顯微鏡觀察:取左上肺組織，在10%甲醛固定液中固定24 h，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。電鏡觀察:?。? mm×1 mm×1 mm的組織塊。2.5%戊二醛(磷酸緩沖液配制)固定2 h。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次。1%鋨酸固定液固定2～3 h。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次。用乙醇－丙酮系列梯度脫水后Epon-812包埋，超薄切片機(jī)切片50～60 nm。3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、拍片。

3.3 PaO2的測(cè)定 抗凝注射器右側(cè)股動(dòng)脈取血0.5～1 mL，通過(guò)全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定PaO2后采用公式PaO2/FiO2計(jì)算氧合指數(shù)。

3.4 肺組織SOD和MDA的檢測(cè) 取右肺組織各3塊，大小為3 mm×4 mm×3 mm，上、中、下肺葉各取1塊。用超聲勻漿機(jī)(19 000 r/min)制成10%肺勻漿，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)肺組織中MDA含量，用鄰苯三酚自氧化抑制法測(cè)定SOD的活性，SOD和MDA采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，所取波長(zhǎng)分別為570 nm和540 nm，按照試劑說(shuō)明書(shū)的計(jì)算方法檢測(cè)SOD活性及MDA含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肺組織的光鏡觀察

Sham組肺組織肉眼觀察表面呈均勻粉紅色，胸膜光滑，彈性好，切面無(wú)明顯液體溢出。光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無(wú)液體滲出。肺泡間隔無(wú)增寬，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管內(nèi)未見(jiàn)透明血栓，無(wú)壞死形成，見(jiàn)圖1A。

I/R組肺組織肉眼觀察表面呈暗紅色，尤以兩下肺為明顯，胸膜尚光滑，彈性較差，切面可見(jiàn)大量血性泡沫樣液體溢出。光鏡下可見(jiàn)胸膜下廣泛出血。肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)出血、水腫液滲出。肺泡間隔明顯增寬，間質(zhì)充血、水腫，彌漫性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。并見(jiàn)散在毛細(xì)血管內(nèi)透明血栓形成，局灶壞死，細(xì)胞核消失，肺泡壁破壞，但肺泡輪廓保留，肺泡塌陷，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Light microscopic images of the lung tissues exposed to ischemia/reperfusion(I/R)stress(HE staining，scale bar=50 μm).A:sham group;B:I/R group;C:DADLE group.圖1 光鏡觀察缺血再灌注繼發(fā)的肺損傷組織改變

DADLE處理組顯示肺損傷有一定程度的減輕，光鏡下可見(jiàn)肺泡壁大部分完好，間質(zhì)充血、水腫，肺泡腔出血、水腫減少，僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)透明血栓。壞死灶數(shù)目和范圍減少，見(jiàn)圖1C。

2 各組大鼠肺組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變

Sham組可見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，連接緊密，基底膜完整，線粒體嵴清楚，板層小體數(shù)量未見(jiàn)改變，微絨毛完整，見(jiàn)圖2A。

I/R組可見(jiàn)毛細(xì)血管腔內(nèi)見(jiàn)多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)堵塞。Ⅱ型上皮細(xì)胞表面微絨毛明顯減少，線粒體腫脹，板層小體減少，出現(xiàn)較多空泡。肺間質(zhì)水腫，可見(jiàn)PMN浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2B。

DADLE處理組可見(jiàn)基底膜基本完整，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，少數(shù)有水腫。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。微絨毛無(wú)明顯脫落，線粒體腫脹不明顯，板層小體無(wú)明顯減少;肺泡間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯的PMN浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2C。

Figure 2.Transmission electron microscopic images of the lung tissue exposed to ischemia/reperfusion(I/R)stress(scale bar=1 μm).A:sham group;B:I/R group;C:DADLE group.圖2 電鏡觀察缺血再灌注繼發(fā)肺損傷組織改變

3 各組血氧分壓和氧合指數(shù)的變化結(jié)果

I/R組大鼠動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)明顯降低，與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DADLE處理組動(dòng)脈血氧分壓和氧合指數(shù)有升高趨勢(shì)，與I/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓和氧合指數(shù)的比較Table 1.The changes of rat arterial blood oxygen partial pressure(PaO2)and oxygenation index(OI)(Mean±SD.n=10)

4 大鼠肺組織MDA含量和SOD活性的變化

各組處理大鼠的肺組織SOD活性及MDA濃度結(jié)果見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織MDA濃度升高，而SOD活性降低，有顯著差異(P＜0.05)。與模型組比較，DADLE處理組可使損傷肺組織中SOD活性有所升高，并降低MDA濃度。SOD活性和MDA含量變化均有顯著差異(P＜0.05)。

表2 大鼠肺組織MDA含量和SOD活性的變化Table 2.The changes of MDA level and SOD activity in the rat lung tissues(Mean±SD.n=10)

討 論

國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示急性全腦缺血性再灌注損傷的機(jī)制，主要有缺血缺氧與能量代謝異常、興奮性氨基酸毒性、超氧陰離子的損傷機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、無(wú)復(fù)流現(xiàn)象、細(xì)胞因子、凋亡等，其中研究較多的是細(xì)胞因子與神經(jīng)元凋亡機(jī)制［2-3］。但是，急性全腦缺血再灌注損傷不僅引起腦組織不同程度的損傷，而且還可誘發(fā)遠(yuǎn)隔重要臟器的損傷，尤其是心肺損傷［4］。Pelosi等［5］報(bào)道在顱腦損傷患者中，腦外器官功能不全最常見(jiàn)的器官為肺?？赡軝C(jī)制為:(1)神經(jīng)源性肺水腫;(2)通氣－血流比例失調(diào);(3)實(shí)質(zhì)性結(jié)構(gòu)損害，包括呼吸方式的改變、炎癥介質(zhì)兒茶酚胺的釋放以及作為感染或創(chuàng)傷的直接結(jié)果。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)急性腦缺血早期可導(dǎo)致肺損傷，損傷后肺組織出現(xiàn)典型的病理生理改變，主要表現(xiàn)為肺水腫和炎癥變化。

本實(shí)驗(yàn)觀察到在急性全腦缺血性再灌注損傷中肺臟的光鏡和電鏡病理表現(xiàn)為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)破壞、發(fā)生凋亡或壞死，由中性粒細(xì)胞為主介導(dǎo)的肺臟局部炎癥反應(yīng)致肺毛細(xì)血管通透性增高，肺泡液滲出，形成富含蛋白質(zhì)的肺水腫及透明膜形成，表明在急性大鼠全腦缺血再灌注可致肺損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道中該動(dòng)物模型的死亡大鼠病理表現(xiàn)相吻合［6-7］。但該動(dòng)物模型中并發(fā)肺損傷的死亡率，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道未見(jiàn)明確闡述，尚需進(jìn)一步探討。

實(shí)驗(yàn)研究已表明δ受體激動(dòng)劑能顯著提高心肌的舒張功能，具有提高組織氧利用率、維持組織氧代謝平衡的作用，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用［3］。目前尚未見(jiàn)關(guān)于δ阿片受體激動(dòng)劑對(duì)急性全腦缺血性再灌注損傷所致的遠(yuǎn)隔臟器肺損傷的保護(hù)作用研究。本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果表明應(yīng)用DADLE治療后，光鏡及電鏡下可見(jiàn)肺泡壁大部修復(fù)，間質(zhì)肺泡水腫減少，僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷有一定程度的減輕，表明DADLE治療可為缺血缺氧的肺組織提供保護(hù)作用。DADLE處理組動(dòng)脈血氧分壓、氧合指數(shù)有升高趨勢(shì)，與I/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

自由基對(duì)生物大分子的氧化作用可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而SOD是一類金屬酶，分布于生物體各組織內(nèi)，能清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基［6］。本實(shí)驗(yàn)表明腦缺血再灌注的肺組織內(nèi)SOD活性降低，MDA含量升高。MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷反應(yīng)的一種產(chǎn)物，是反映機(jī)體氧化損傷程度經(jīng)典有效指標(biāo)之一［7］。急性大鼠全腦缺血再灌注可致大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生，同時(shí)機(jī)體清除氧自由基的能力明顯下調(diào)。這些活性氧損傷肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管細(xì)胞，使肺泡毛細(xì)血管膜的屏障功能減弱，對(duì)液體和大分子物質(zhì)的通透性增高，形成肺水腫［8］。為了研究DADLE減輕肺損傷的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了肺組織SOD活性及MDA水平。結(jié)果表明DADLE治療可升高損傷肺組織的SOD活性，并降低MDA濃度。

文獻(xiàn)報(bào)道DADLE可能通過(guò)多種機(jī)制抗細(xì)胞缺氧損傷作用，DADLE可增加ERK途徑酪氨酸激酶的磷酸化水平，降低了缺氧無(wú)糖性細(xì)胞損傷誘發(fā)的p38的磷酸化，且ERK磷酸化和p38磷酸化處于動(dòng)態(tài)平衡中［9-10］。從而減輕肺組織缺氧造成的能量代謝紊亂，減少細(xì)胞和組織損傷的作用，從而減輕肺組織細(xì)胞水腫，減輕全腦缺血再灌注的肺損傷［11］。

DADLE在急性腦缺血再灌注損傷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的作用在不少實(shí)驗(yàn)研究已得到證實(shí)，但對(duì)后繼性肺組織損傷的影響較少報(bào)道。本研究結(jié)果顯示DADLE能減輕該模型中的肺損傷，具有一定的保護(hù)作用，但其對(duì)死亡率有何影響，是我們將進(jìn)一步深入探討的問(wèn)題。

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