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    線粒體損傷在創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡中的作用*

    2014-11-08 02:28:10徐水凌張新紅邵平揚鄭文文
    中國病理生理雜志 2014年9期
    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)膜電位弧菌

    徐水凌, 朱 佳, 張新紅, 邵平揚, 鄭文文

    創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)屬一種分布于海洋魚類及貝母類、嗜鹽性革蘭陰性桿菌,主要經(jīng)接觸疫水或攝入被其污染的海產(chǎn)品,引起傷口感染、胃腸炎或原發(fā)性敗血癥,具有起病急、病情進展快、致死率高等特征[1-4],是沿海地區(qū)一種致死率高的重要傳染?。?]。創(chuàng)傷弧菌進入機體后,與宿主免疫細胞之間的相互作用,是了解和認識這種細菌致病機制的重要方面,也為臨床尋找創(chuàng)傷弧菌感染的治療靶點提供重要的理論基礎(chǔ),創(chuàng)傷弧菌的致病機制值得深入研究。樹突狀細胞(dentritic cell,DC)作為重要的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC),在創(chuàng)傷弧菌感染的保護性免疫中起著始動者作用[6]。線粒體被認為是控制細胞凋亡或壞死的樞紐,可通過釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和細胞色素 C(cytochrome C,Cyt C)使細胞發(fā)生凋亡[7]。創(chuàng)傷弧菌感染樹突狀細胞后的線粒體損傷可能與細胞凋亡相關(guān)。因此,了解線粒體損傷在創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡過程中的作用及其可能機制,NF-κB p65和TNF-α信號分子是否表達以及與細胞凋亡的關(guān)系,對深入闡明創(chuàng)傷弧菌的致病機制具有重要意義。

    材料和方法

    1 材料

    創(chuàng)傷弧菌(Vv 1.1758株)購于中國科學(xué)院微生物研究所;小鼠樹突狀細胞(DC2.4)細胞株由浙江大學(xué)免疫研究所惠贈,本實驗室常規(guī)培養(yǎng)并保存。RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自杭州四季青生物制品有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Ameresco;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;鈣離子熒光探針Fluo-8/AM購自Abcam;NF-κB p65和 TNF-α鼠單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology;羊抗鼠IgG-HRP購自Thermo;ECL免疫印跡底物購自Bio-Rad。

    2 方法

    2.1 Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞混合培養(yǎng)模型建立Vv 1.1758經(jīng)37℃、哥倫亞血瓊脂培養(yǎng)基孵育24 h,挑取生長良好的菌落,無菌 PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)洗3次后,重懸于不含抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),調(diào)整其細菌濃度為2.0×1010CFU/L,備用。取6孔細胞培養(yǎng)板,接種DC2.4細胞(5.2×108/L)各 2 mL,于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。小心吸棄培養(yǎng)液,每孔加入2 mL 10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液(無抗生素),分別孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液,按細菌∶細胞(MOI)約為40∶1的比例,每孔加入Vv 1.1758懸液1 mL(濃度為2.0×1010CFU/L),Vv 1.1758與 DC2.4細胞在37 ℃分別共培育0、1、2、3、4、5 和6 h 時回收細胞。

    2.2 掃描電鏡觀察Vv 1.1758侵入的DC2.4細胞收集0、2、4和6 h時段與 Vv 1.1758共育的 DC2.4細胞,棄培養(yǎng)液,加PBS吹打,2 500 r/min離心10 min,重復(fù)2次,以2%戊二醛磷酸緩沖液4℃固定2 h,PBS 洗3 次,每次30 min,1%鋨酸固定1.5 h,PBS洗3次,每次30 min;梯度乙醇、丙酮逐級脫水;經(jīng)置換、常規(guī)臨界點干燥、粘臺、噴金后,掃描電鏡下觀察Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的形態(tài)學(xué)變化。

    2.3 透射電鏡觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4細胞,4%(V/V)戊二醛4℃固定2 h,PBS洗3次,鋨酸再固定,丙酮脫水,樹脂包埋,超薄切片后鉛鈾染色,透射電鏡下觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

    中國的茶葉在國際茶葉銷售市場上的認可度普遍偏低,西方發(fā)達國家對我國出口的茶葉標準尤為嚴苛。江西出口茶葉缺乏自有知名品牌,這不僅影響出口貿(mào)易的收益,也不利于出口茶葉的國際競爭力的提高,更不利于對外貿(mào)易的持續(xù)發(fā)展。

    2.5 細胞內(nèi)Ca2+離子水平檢測 采用Ca2+熒光探針Fluo-8/AM單染色法標記,收集上述共培育時段的5.2×108/L DC2.4細胞,以D-Hanks液洗滌3次,加入5 μmol/L Fluo-8/AM染液,37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min負載探針,Hanks洗滌3次。熒光顯微鏡及熒光成像系統(tǒng)掃描記錄不同處理時點細胞內(nèi)熒光強度,細胞熒光復(fù)合物的熒光強度經(jīng)計算機軟件(Zeiss)計算。

    2.4 細胞內(nèi)ROS水平的檢測 采用DCFH-DA染色法檢測 DC2.4 細胞內(nèi) ROS。收集 0、1、2、3、4、5 和6 h時段與 Vv 1.1758 共培育的 5.2 ×108/L DC2.4細胞爬片,每個載玻片中加入含10 μmol/L DCFHDA的無抗生素、無血清的RPMI 1640各600 μL,37℃避光孵育30 min,PBS洗滌載玻片3次,自然干燥,50%丙三醇/PBS封片,熒光顯微鏡及熒光成像系統(tǒng)掃描記錄不同共育時點細胞內(nèi)熒光強度(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長527 nm),熒光圖像經(jīng)計算機軟件(Zeiss)計算細胞內(nèi)熒光物的熒光強度。

    2.6 細胞線粒體膜電位檢測 收集0、2、4和6 h時段Vv 1.1758共培育的DC2.4細胞(各時段均設(shè)4個復(fù)孔),加入JC-1染色工作液(5 mg/L),37℃孵育20 min,以JC-1染色緩沖液洗滌2次,2 000 r/min、4℃離心5 min,收集細胞,PBS離心、洗滌2次后,以FL-1為綠色熒光檢測通道,F(xiàn)L-2為紅色熒光檢測通道,流式細胞術(shù)檢測綠色熒光率以反映線粒體膜電位的變化。

    侵入前,DC2.4細胞線粒體飽滿呈橢圓形粒狀,線粒體嵴分布清晰 (圖2A)。侵入時,Vv 1.1758與DC2.4細胞共育2 h,DC2.4細胞線粒體呈輕微球形腫脹,線粒體嵴出現(xiàn)斷裂,基質(zhì)變淡(圖2B);4 h時,線粒體呈高度球形腫脹,線粒體嵴模糊不清(圖2C);6 h時,線粒體膜破碎,嵴完全消失,大量空泡形成,細胞器結(jié)構(gòu)紊亂(圖2D)。

    與 Vv 1.1758 和 DC 2.4 細胞共培育 0 h(65.6±7.8)比較,NF-κB p65 蛋白在共培育 1 h(98.8 ±10.2)、2 h(96.3 ± 9.1)、3 h(124.5 ± 13.5)、4 h(168.5 ±18.9)、5 h(198.5 ±19.6)和6 h(192.0 ±18.6)的表達量均上升(P <0.05);而 TNF-α 蛋白與共培育0 h(31.6 ±6.2)比較,2 h(58.3 ±8.2)、3 h(59.4 ±8.9)、4 h(63.4 ±8.7)、5 h(64.2 ±8.5)和6 h(92.6±9.6)的表達量上升(P <0.05),見圖 7。NF-κB p65蛋白表達在共培育1 h即開始升高,TNF-α蛋白則在共培育2 h開始增高。

    侵入前,DC2.4細胞核呈圓形或橢圓形,細胞表面光滑,細胞間隔清晰(圖1A);侵入時,Vv 1.1758與DC2.4細胞混合培養(yǎng)2 h,可見有少量Vv 1.1758菌體一端黏附于細胞表面(圖1B);4 h時,DC2.4細胞呈現(xiàn)輕微腫脹,細胞有較多的Vv 1.1758黏附,Vv 1.1758以菌體一端與細胞表面結(jié)合方式侵入細胞(圖1C);6 h時,DC2.4細胞呈現(xiàn)高度腫脹,細胞表面出現(xiàn)點狀的球狀突起,Vv 1.1758菌體整體黏附于細胞表面并侵入細胞(圖1D)。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。各樣本先進行方差齊性檢驗,再采用單因素方差分析法對資料進行處理,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞共育3、4、5 和6 h時,胞內(nèi) Ca2+熒光強度分別為 40.2 ±4.8、58.2 ±6.8、60.6±5.8 和 68.6 ±5.2,與對照組(18.4 ±2.2)比較,差異顯著(P <0.05),見圖4。這提示 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞后可導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+升高。

    結(jié) 果

    1 掃描電鏡觀察DC2.4細胞的形態(tài)學(xué)變化

    中南佛州水利工程的設(shè)計與施工完全由聯(lián)邦政府主導(dǎo),到20世紀70年代基本竣工。從本質(zhì)上講,該項目有很大的應(yīng)急成分,因此,在應(yīng)用、管理過程中一些過去沒有考慮到的問題逐漸顯現(xiàn)。

    Figure 1.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under scanning electronic microscope(×8 500,scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ~ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2,4 and 6 h,respectively.圖1 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的掃描電鏡照片

    2 透射電鏡觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)

    2.7 細胞凋亡率檢測 按上述方法收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4 細胞,以 PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)洗滌3次,然后分別用Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)染色,按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書,流式細胞術(shù)檢測各時段的細胞凋亡情況,計算細胞凋亡率。

    Figure 2.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under ttransmission electronic microscope(×16 000,scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ~ D:represented the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2,4 and 6 h,respectively.圖2 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的透射電鏡照片

    3 DC2.4細胞內(nèi)的ROS水平

    Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞共培育2、3、4、5 和6 h時,DC2.4 細胞內(nèi)的熒光強度分別為 28.9 ±5.6、31.2 ±7.8、37.2 ±6.9、49.6 ±8.9 和 38.6 ±7.2,顯著高于對照組(9.8 ±1.2;P <0.05),見圖 3。這提示ROS在DC2.4細胞線粒體損傷和細胞凋亡中可能發(fā)揮重要的作用。

    Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time(×200,scale bar=10 μm).Mean ± SD.n=4.*P <0.05,**P < 0.01 vs control.圖3 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間細胞內(nèi)ROS熒光強度的變化

    4 DC2.4細胞胞內(nèi)Ca2+的變化

    飛速發(fā)展的信息技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于課程教學(xué)中,與英語課程的融合日益加強。信息化教學(xué)對英語教師提出了更高的要求,教師不僅要及時更新和拓展自己的信息知識結(jié)構(gòu),更要具備靈活運用信息技術(shù)的能力。當前,各高校大部分英語教師的信息素養(yǎng)不高,信息技術(shù)知識比較匱乏,主要局限于簡單的PPT課件制作,對較復(fù)雜的教學(xué)編輯軟件操作不熟悉。英語教師信息技術(shù)應(yīng)用能力不高,一方面緣于教師自身沒有及時更新知識所致,另一方面各高校組織英語教師進行有關(guān)信息技術(shù)應(yīng)用的培訓(xùn)較少,這成為制約當前高校英語數(shù)字化教學(xué)資源共建共享的瓶頸。

    5 DC2.4細胞線粒體膜電位的變化

    Vv 1.1758與 DC2.4細胞共培育2、4和6 h后,流式細胞術(shù)檢測細胞綠色熒光率分別為(18.9±3.5)%,(49.9 ±8.7)%和(62.5 ±11.5)%,顯著高于對照組[(6.9 ±0.6)%;P <0.05],線粒體膜電位分別下降 12.0%、43.0%和 46.6%,見圖 5。

    6 Vv 1.1758 誘導(dǎo) DC2.4 細胞凋亡

    Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞混合培養(yǎng)2、4 和6 h,細胞凋亡率分別為(27.8 ±8.6)%、(36.3 ±11.7)%和(56.8±15.6)%,顯著高于正常 DC2.4細胞對照組[(3.2 ±0.8)%;P <0.05],并呈一定的時間依賴性,見圖6。

    Figure 4.Intracellular Ca2+fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.Mean ± SD.n=4.*P <0.05,**P < 0.01 vs control.圖4 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間細胞內(nèi)Ca2+的變化

    Figure 5.The changes of mitochondrial transmembrane potential of the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.A:the control DC2.4 cells before invasion;B ~ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2 h,4 h and 6 h,respectively.圖5 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間線粒體膜電位的變化

    Figure 6.Apoptotic rates of the DC2.4 cells induced by Vv 1.1758.A:the normal DC2.4 cells;B ~ D:the apoptotic rates of DC2.4 cells co-culture with Vv 1.1758 for 2 h,4 h,6 h,respectively.圖6 Vv 1.1758誘導(dǎo)DC2.4細胞凋亡率變化

    7 NF-κB p65 和 TNF-α蛋白的表達

    2.8 Western blotting檢測 收集 0、1、2、3、4、5 和 6 h共育時段的 DC2.4細胞,加入250 μL含 PMSF的RIPA細胞裂解液,超聲破碎細胞(300 V,1 s×5),15 000 r/min(離心半徑7.5cm)離心10 min,BCA 法測定上清液蛋白濃度,加等體積的2×電泳加樣緩沖液,95℃水浴5 min,上樣,電泳(濃縮膠20 mA,分離膠35 mA),電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(120 mA,120 min),10%脫脂奶粉室溫封閉4 h,TBST漂洗3次,分別加入1∶200稀釋的 NF-κB p65和 TNF-α 鼠單克隆抗體,4℃孵育過夜,1∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRPⅡ抗孵育2 h,TBST洗膜3次后ECL顯色,ChemiDocTMMP系統(tǒng)記錄不同時段 NF-κB p65和TNF-α的表達。以Quality One軟件計算蛋白產(chǎn)物條帶的相對吸光度值。

    Figure 7.Western blotting analysis of NF-κB p65 and TNF-α expression in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.圖7 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間NF-κB p65和TNF-α蛋白表達的變化

    討 論

    DCs是人體內(nèi)重要的免疫細胞,其作為體內(nèi)重要的抗原遞呈細胞,在抗病原菌早期感染及其抗原的加工和提呈中起著重要的作用[8-9]。在創(chuàng)傷弧菌與免疫細胞間相互作用的研究中發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷弧菌可將淋巴細胞作為靶細胞誘導(dǎo)淋巴細胞發(fā)生凋亡[10],巨噬細胞也可發(fā)生類似的細胞凋亡作用[11]。創(chuàng)傷弧菌能否誘導(dǎo)DC凋亡,從而實現(xiàn)免疫逃逸,達到在體內(nèi)生存并繁殖的目的,對深入了解創(chuàng)傷弧菌感染的致病機制,為臨床治療選擇合理的治療靶位具有重要意義。

    3.施工企業(yè)綜合競爭力不斷增強。通過清理項目管理程序、規(guī)范管理制度、優(yōu)化項目管理組織,促進了先進的管理方式、先進管理理念的運用。強化了項目前期風險防控,優(yōu)化施工組織,引進了先進工藝,企業(yè)產(chǎn)能工程達產(chǎn)率逐步提升,經(jīng)濟效益得到提高,施工隊伍素質(zhì)和管理水平得到提高,企業(yè)的客戶滿意率不斷上升,外部市場開拓空間不斷加大,企業(yè)核心競爭力穩(wěn)步增強。

    線粒體不僅是細胞的能量工廠,而且也是細胞凋亡的調(diào)控中心,主要經(jīng)Cyt C-caspase-9依賴途徑和非caspase依賴途徑調(diào)控細胞凋亡,眾多致病因素如:病原菌感染、炎癥反應(yīng)、缺血-再灌注等均可通過線粒體的損傷而誘導(dǎo)細胞凋亡[12-13]。我們先前已發(fā)現(xiàn),Vv感染DC可通過TLR2、4受體表達上調(diào),TNF-α炎癥介質(zhì)增加導(dǎo)致DNA降解,誘導(dǎo)DC細胞凋亡和壞死[14]。本實驗經(jīng)掃描和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),Vv 1.1758與DC2.4細胞混合培養(yǎng)2 h,即可有少量Vv 1.1758菌體一端黏附于細胞表面,線粒體呈輕微球形腫脹,線粒體嵴出現(xiàn)斷裂,基質(zhì)變淡;共育4 h時,DC2.4細胞表面則有較多的Vv 1.1758黏附,以菌體一端與細胞表面結(jié)合方式侵入細胞,細胞線粒體呈高度球形腫脹,線粒體嵴模糊不清;6 h時,菌體整體黏附于細胞表面并侵入細胞,DC2.4細胞呈現(xiàn)高度腫脹并出現(xiàn)點狀的球狀突起,線粒體膜破碎,嵴完全消失,胞內(nèi)有大量空泡形成。提示:Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的早期,即可引起DC線粒體損傷。此外,線粒體呼吸鏈是細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場所,胞內(nèi)ROS的升高可引起線粒體的損傷,DCFH-DA是目前最為常用和靈敏的胞內(nèi)ROS檢測的熒光探針,DCF的熒光強度可反映胞內(nèi)ROS水平[15]。本實驗結(jié)果顯示,Vv 1.1758與 DC2.4細胞共育2 h時,ROS即開始升高,至5 h達高峰。我們推測:Vv 1.1758引起的DC2.4細胞線粒體損傷,與胞內(nèi)ROS的升高密切相關(guān)。

    田林平塘高山漢族諺語研究——百色市高山漢族語言文化系列研究之一 ………………………………………… 黃 革(6/64)

    電網(wǎng)調(diào)度系統(tǒng)容易受到一些不可抗因素的影響,例如自然災(zāi)害等。一旦遇到大的自然災(zāi)害,電網(wǎng)將會有可能中斷。這時,必須建立起應(yīng)急響應(yīng)機制,使得電網(wǎng)調(diào)度能夠在自然災(zāi)害發(fā)生后電網(wǎng)出現(xiàn)故障的情況下,應(yīng)急機制能夠及時發(fā)揮作用。當前的許多地方,由于對自然災(zāi)害等不可抗因素的認識不夠充分,重視程度不夠,或者沒有建立應(yīng)急響應(yīng)機制或者是應(yīng)付差事的應(yīng)急響應(yīng)機制,這就嚴重影響了電網(wǎng)的安全運行。

    線粒體除合成機體所需的ATP外,也具有攝取、釋放、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用。大量研究證實,細胞內(nèi)鈣失衡是啟動細胞凋亡的關(guān)鍵因素[16]。胞內(nèi)Ca2+增多,可引起線粒體膜電位降低,從而使線粒體內(nèi)貯鈣進一步釋放,引起細胞內(nèi)鈣持續(xù)增加以及DNA斷裂,由此形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致細胞凋亡或死亡;此外,ROS也可加劇 Ca2+的超載[17]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),Vv 1.1758與DC2.4細胞共育3 h時,細胞內(nèi)Ca2+迅速升高,并隨共育時間的延長,細胞內(nèi)Ca2+升高更趨明顯,呈一定的時間依賴性;共育2 h、4 h和6 h時,線粒體膜電位值分別下降12.0%、43.0%和46.6%;細胞凋亡率則分別為(27.8±8.6)%,(36.3 ±11.7)%和(56.8 ±15.6)%,明顯高于正常DC2.4細胞對照組(3.2±0.8)%(P<0.05)。我們認為創(chuàng)傷弧菌在侵入DC2.4細胞時,同樣存在著細胞內(nèi)鈣的失衡,胞內(nèi)Ca2+濃度的顯著升高和線粒體膜電位下降,是誘導(dǎo)DC2.4細胞發(fā)生凋亡的另一重要環(huán)節(jié)。

    NF-κB是眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)表達的轉(zhuǎn)錄因子之一,主要由兩種Rel家庭蛋白構(gòu)成的同源或異源二聚體蛋白質(zhì),p65是Rel家庭成員之一,其表達與免疫和炎癥反應(yīng)高度相關(guān),NF-κB p65的活化可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量TNF-α、IL等促炎因子,參與細胞凋亡等多種生物過程[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),NF-κB p65 蛋白在Vv 1.1758與DC2.4細胞共育1 h,即開始升高,至5 h達高峰,共育6 h稍有下降;TNF-α蛋白則在共育2 h開始增高,至6 h達高峰。這提示:NF-κB p65和TNF-α有可能是創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡過程中的重要信號分子。

    我們的實驗結(jié)果表明,線粒體損傷在Vv 1.1758誘導(dǎo)DC2.4細胞凋亡中起著重作用,其機制可能與胞內(nèi)ROS的升高、Ca2+濃度的顯著升高和線粒體膜電位下降有關(guān),NF-κB p65和TNF-α有可能是細胞凋亡過程中的重要信號分子。然而,在線粒體損傷時,非caspase依賴的AIF、核酸內(nèi)切酶G等是否釋放表達,尚有待進一步研究證實。

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